甘蔗宿根矮化病PCR检测技术优化分析

【目的】在PCR的基本程序上,以甘蔗宿根矮化病菌Lxx16S～23S rDNA内部转录间隔区特异性引物,优化PCR反应条件,以建立稳定、快速、灵敏度高的甘蔗宿根矮化病PCR检测技术。【方法】以Lxx基因组DNA为模板,采用TaKaRa的Ex Taq Polymerase和2×GCBufferⅡ,调整退火温度和引物浓度等主要因子,优化PCR反应体系;稀释Lxx基因组DNA模板的浓度,检测优化PCR的灵敏度;用优化的PCR对田间生长的甘蔗品种GT11叶片总DNA进行RSD测定。【结果】优化的PCR得到清晰特异的条带为Lxx16S～23S rDNA内部转录间隔区序列;能从稀释1000倍的Lxx基因组DNA(15.9pg/μL)中检测到Lxx,而常规的PCR只能从稀释100倍的Lxx基因组DNA(159pg/μL)中检测到Lxx,且出现假阴性,不稳定。对田间生长的甘蔗品种GT11叶片总DNA进行PCR检测,结果用优化后的PCR检测RSD感染率为66.7%,而常规的PCR检测RSD感染率为0。【结论】优化的PCR体系为:2×GCBufferⅡ12.5μL,Ex Taq DNA酶(5U/μL)0.2μL;dNTP(2.5mmol/L)1.5μL;Lxx1(10μmol/L)1.0μL,Lxx2(10μmol/L)1.0μL,DNA模板1.0μL,用ddH2O双蒸水补足至25.0μL。PCR反应程序为:95℃预变性10min,94℃15s,57℃15s,72℃30s,40个循环;72℃延伸10min。优化的PCR比常规PCR的灵敏度高、结果稳定、检测效率高,更适合于田间大批量样品快速检测。