甘蔗ABA生物合成关键酶SoNCED基因克隆及表达分析

【目的】克隆甘蔗体内9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase,NCED)基因,分析其基本生物学信息及在逆境胁迫下的表达分析,为进一步探讨So NCED基因在甘蔗脱落酸(ABA)生物合成途径中的作用提供理论依据。【方法】以甘蔗品种桂糖21号为材料,待蔗苗长至5~6片叶时分别进行干旱、低温、高盐和氧化胁迫处理,利用反转录PCR(RT-PCR)和c DNA未端快速扩增(RACE-PCR)克隆So NCED基因,应用生物信息学方法对获得的氨基酸序列进行分析,构建原核表达载体并进行目的蛋白的诱导表达,通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析So NCED基因在受到不同逆境胁迫时的表达情况。【结果】克隆获得的So NCED基因(Gen Bank登录号JQ314108),c DNA全长为2521 bp,包含1个1827 bp的开放阅读框(ORF),编码608个氨基酸。多重序列比对及系统发育进化树分析结果表明,So NCED基因编码的氨基酸序列与其他植物有一定的相似性,尤其与禾本科C4植物高粱和玉米的同源性最高,均达96%。成功构建So NCED基因的原核表达载体p ET-So NCED,且通过IPTG诱导时可得到约66.0 k D的蛋白,确定该蛋白为So NCED基因的表达蛋白。q RT-PCR结果分析表明,So NCED基因在干旱、低温、高盐和氧化胁迫下均能诱导表达,其中氧化胁迫下其表达量在6 h时达峰值,其他胁迫方式下其表达量在12 h时达峰值。【结论】成功克隆获得甘蔗So NCED基因,并从不同逆境下的表达情况推测该基因在甘蔗体内参与了干旱、低温、高盐和氧化等非生物胁迫的调控过程。

低温胁迫下外源ABA对甘蔗幼苗抗寒性及内源激素的影响

为探讨外施ABA(脱落酸)对甘蔗抗寒性的影响,以抗寒性强的甘蔗品种桂糖28号和抗寒性弱的甘蔗品种园林6号为材料,喷施100μmol/L ABA于甘蔗幼苗叶片,12 h后进行低温胁迫,然后于不同时间采叶样,研究甘蔗幼苗在低温胁迫和ABA处理下叶片细胞膜透性、丙二醛(MDA)、脯氨酸及内源激素含量的变化。结果表明:低温胁迫下,甘蔗幼苗细胞膜受破坏,GA3(赤霉素)含量下降;丙二醛、脯氨酸、ABA含量及相对电导率、ABA/GA3、ABA/IAA和ABA/ZR升高。外施ABA能有效缓解低温胁迫对细胞膜的影响,降低MDA、GA3含量,提高脯氨酸、ABA含量及ABA/GA3,从而提高甘蔗幼苗的抗寒性。低温胁迫下,植株体内低MDA、GA3含量,高脯氨酸、ABA含量及高ABA/GA3值是甘蔗高抗寒性的重要生理基础。

甘蔗中性/碱性转化酶基因SoNIN1的克隆和表达分析

中性/碱性转化酶(Alkaline/Neutral Invertase)能不可逆地催化蔗糖分解为葡萄糖和果糖,在植物生长发育中起重要作用。本研究采用RT-PCR和RACE技术从甘蔗品种GT28心叶中克隆到甘蔗中性/碱性转化酶基因全长cDNA序列,基因命名为SoNIN1。该基因全长2289 bp(GenBank登录号为JX109944),开放阅读框为1812 bp,编码603个氨基酸,相对分子量为67.79 kD,等电点为6.41。具有中性/碱性转化酶保守结构域,N-端不含跨膜结构和信号肽。其编码氨基酸序列与玉米、水稻和黑麦草的亲缘关系较近,属于同一进化分支。利用染色体步移技术克隆到SoNIN1基因5′侧翼启动子序列,长度为1174 bp(GenBank登录号为KC854419)。启动子序列含有多个CAAT-box和TATA-box等基本作用元件,参与分生组织特异性激活,参与干旱诱导的MYB结合位点,脱落酸、茉莉酸甲酯和赤霉素响应等作用元件。利用实时荧光定量PCR技术,在生理成熟期甘蔗茎、叶、花序和芽中均能检测到SoNIN1的表达,其表达量在叶中最高,芽中次之,而在+1节间最低。苗期根和叶中SoNIN1基因都受PEG和NaCl诱导表达。

甘蔗可溶性酸性转化酶(SoSAI1)基因的克隆及表达分析

【目的】克隆甘蔗可溶性酸性转化酶基因(SoSAI1)全长cDNA序列和5侧翼启动子序列,并分析其序列特征和基因表达模式。【方法】利用RACE技术克隆SoSAI1的全长cDNA序列,应用生物信息学软件分析SoSAI1预期编码蛋白特征;采用Genome Walking技术克隆SoSAI1的启动子序列;采用实时荧光定量PCR分析不同生长期SoSAI1在甘蔗叶和茎中的表达,以及PEG 6000、100 mmol·L-1NaCl和6℃胁迫下,SoSAI1在甘蔗苗期根和叶中表达模式。【结果】SoSAI1的cDNA序列全长为2 387 bp,ORF长2 058 bp,编码685个氨基酸,预测其分子量和等电点分别为74.44 kD和5.6,GenBank登录号为JQ406875。5侧翼启动子序列长417 bp,含有胚乳特异表达顺式作用元件和参与干旱诱导的MYB结合位点,GenBank登录号为KC862314。SoSAI1表达在生理成熟期的花序和花序轴中较高,而在成熟茎和老茎中较低。15%PEG和6℃能诱导叶中SoSAI1表达,而15%PEG和NaCl能诱导根中SoSAI1表达。【结论】获得SoSAI1全长cDNA序列和部分启动子序列,SoSAI1在甘蔗生长发育和蔗糖积累,并在应对环境胁迫中发挥作用。

水分胁迫下甘蔗差异表达基因筛选及激素相关基因分析

甘蔗是经济和环境上日益重要的C4作物,干旱在全球范围内严重限制甘蔗产量。了解甘蔗对水分胁迫反应的分子机制将有助于甘蔗抗旱性的分子遗传改良。利用基因芯片技术分析水分胁迫下甘蔗叶片的15 593个基因的表达谱,结果表明,中、重度胁迫下的差异表达基因数量分别为300个和853个,中度胁迫中差异基因以上调表达为主,重度胁迫中下调表达占多数。功能注释分析显示,差异表达基因分子功能主要为结合、载体和催化活性,主要参与代谢、细胞和生物调控等生物过程。此外,功能未明确的假定蛋白和无匹配信息的基因序列仍占据注释结果的相当一部分,表明还有大量的基因尚待发掘。在水分胁迫下,甘蔗内源ABA和IAA含量显著上升而GA含量显著受到抑制。以参与生物进程分类,对植物激素相关基因进行筛选并分析,发现激素响应表达基因代谢途径具有多样性,显示了激素代谢网络的交叉性与复杂性。挑选9个差异表达程度不同的基因进行实时荧光定量PCR检测,表明芯片数据具有良好的重复性。

引进甘蔗品种抗寒性评价

【目的】探明广西新引进的13个甘蔗品种(系)的抗寒能力及其生理生化特性,并研究蔗区筛选抗寒品种的有效方法。【方法】以当前广西蔗区主栽品种新台糖22号作为对照,对自然低温条件下引进甘蔗品种的农艺性状进行调查,采用隶属函数值法对各品种的抗寒性进行综合分类,并分析比较人工低温条件下各类抗寒品种的生理生化指标。【结果】相比新台糖22号,湖光1号、台糖88-99、CP84-1198和云蔗99-601属于强抗寒性品种;赣蔗18号、C1-2003、园林9号、台糖98-0432、福农15号、台糖98-1626和粤糖96-86属于中抗寒性品种;园林6号和园林8号属于弱抗寒性品种。强抗寒品种的脯氨酸含量比中弱抗寒品种约高25%,可溶性糖含量与中弱抗寒品种相当,可溶性蛋白含量与比弱抗寒品种高19%,丙二醛含量和质膜渗透率与中抗寒品种差异不大,但分别比弱抗寒品种低15%和30%。【结论】湖光1号、台糖88-99、CP84-1198和云蔗99-601属于强抗寒性品种;低温胁迫条件下,叶片脯氨酸、可溶性蛋白和丙二醛含量及质膜渗透率可以较好地反映出甘蔗品种抗寒力高低,可用作评价甘蔗抗寒性的指标。

甘蔗NADP异柠檬酸脱氢酶基因(SoNADP-IDH)的克隆与表达分析

【目的】甘蔗是C4作物,是中国最重要的糖料作物和最有希望的能源作物。克隆甘蔗NADP异柠檬酸脱氢酶(So NADP-IDH)基因,为甘蔗的抗病乃至抗逆育种提供候选基因。【方法】采用双向电泳技术找到差异蛋白点,用质谱技术对相应蛋白点进行鉴定,用RT-PCR技术从甘蔗中克隆So NADP-IDH,用在线软件对获得的氨基酸序列进行分析,并用q RT-PCR技术研究So NADP-IDH在不同组织和不同逆境胁迫条件下的表达特性。【结果】质谱成功鉴定出差异蛋白点并克隆获得该基因,命名为So NADP-IDH,Gen Bank登录号为KF808326。该c DNA全长1 497 bp,含有1个1 239 bp的完整开放阅读框(ORF),编码412个氨基酸。生物信息学分析表明,该蛋白为亲水蛋白,不含信号肽,为稳定蛋白,有跨膜区域,为可溶性蛋白,二级结构分析显示,含有α-螺旋、延伸链、β-转角、无规则卷曲,并且α-螺旋和无规则卷曲占据了该蛋白质二级结构的大部分构成。在线软件分析表明该基因含有19个磷酸化位点、4个N-糖基化位点、4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、4个N-肉豆蔻酰化作用位点、6个蛋白激酶C磷酸化位点和1个酪氨酸激酶磷酸化位点。多重序列和系统进化树分析表明,So NADP-IDH所编码的氨基酸序列与其他植物的异柠檬酸脱氢酶(IDH)蛋白有很高的同源性,与玉米的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析表明,So NADP-IDH在甘蔗的根、茎、叶中均有表达,在甘蔗体内为组成型表达,在生物胁迫(RSD病菌)和4种非生物胁迫下低温(4℃)、干旱(PEG)、高盐(Na Cl)和激素(ABA)均可影响So NADP-IDH在甘蔗体内的表达,且表达模式不同。在PEG模拟的干旱胁迫下,So NADP-IDH的表达表现出先上调后下调的表达模式,6 h表达量升到最高,之后又开始持续下降,在处理48 h时表达量降到最低;在4℃处理的低温胁迫下,3 h时,So NADP-IDH的表达量降到最低,之后随着处理时间的延长,So NADP-IDH的表达量增加,24 h升到最高点,48 h时,又有稍微下降;在ABA作用下,So NADP-IDH表现出"抑-扬-抑-扬"的表达模式,在处理3 h时So NADP-IDH表达量有所降低,6 h时升到最高,在处理24 h时降到最低,48 h又有所上升;在Na Cl模拟的高盐胁迫下,So NADP-IDH表现出"扬-抑-扬"的表达模式,So NADP-IDH的表达量在处理6 h时升到最高,之后开始急剧下降,24 h时降到最低,之后开始有所上升,48 h时基本与对照持平。【结论】从甘蔗中获得了NADP异柠檬酸脱氢酶(So NADP-IDH)基因,RSD病菌的侵染及上述4种非生物逆境胁迫均影响到So NADP-IDH在甘蔗体内的表达水平,该基因可能参与了甘蔗抵抗氧化胁迫的过程。

宿根矮化病菌对甘蔗生长和内源激素的影响

甘蔗宿根矮化病(ratoon stunting disease,RSD)是由Leifsonia xyli subsp.xyli引起的病害。为研究该病对甘蔗的生长和内源激素的影响,选择2个甘蔗品种新台糖22号(ROC22)和果蔗(Badila),采用桶栽种植分别进行3个处理:感染RSD病菌蔗株进行52℃温汤脱菌处理30 min、感染RSD病菌蔗株、健康蔗株(对照),在出苗后90、120、150、180 d测定株高和内源激素的含量,并利用PCR检测确定感病和健康蔗株。结果表明:感染RSD病菌蔗株的株高显著低于对照和温汤脱菌处理;感染RSD病菌处理植株的赤霉素(GA3)、生长素(IAA)含量明显低于对照和温汤脱菌处理,而脱落酸(ABA)含量则相反,感染RSD病菌处理的ABA含量明显高于对照和温汤脱菌处理;对照和温汤脱菌处理的株高和激素含量差异不显著。

甘蔗种质资源抗宿根矮化病特性鉴定

【目的】筛选抗甘蔗宿根矮化病(RSD)种质资源材料,为选育抗RSD甘蔗品种提供优良抗原。【方法】采用浸蔗种的方法对6个系列100份甘蔗品种进行侵染,用建立的RSD-PCR检测方法进行检测,计算各甘蔗品种RSD发病率,并对甘蔗种质资源进行抗性评价。【结果】100份甘蔗品种材料中,GT02/351、CP89/2134、ROC26、粤94/28、福农89/209、崖96/45等品种RSD发病率为0,表现为A级抗性;GT99/181、GT97/228、GT90/95等品种RSD发病率等于10%,表现为B级抗性;GT02/208、GT96/156、ROC22等品种表现为C级抗性;GT21、GT02/237、CP88/1762等品种表现为D级抗性。6个不同系列中,CP系列RSD平均发病率最低,为12.00%,抗性最强;粤糖系列RSD平均发病率最高,为28.57%,抗性较弱。【结论】GT02/351、CP89/2134、ROC26、粤94/28、福农89/209、崖96/45等甘蔗品种具有良好的抗性,具有推广应用价值;CP系列的抗性较强,可作为抗RSD的育种材料。

施氮量对甘蔗叶绿体超微结构和光合速率的影响

【目的】研究施氮量对甘蔗叶片叶绿体超微结构和光合速率的影响,明确氮素影响甘蔗光合作用的细胞学机理,为甘蔗合理施肥提供科学依据。【方法】以甘蔗品种GT11、ROC22和GXB9为试验材料,在温室内进行桶栽试验,设低氮、中氮和高氮3个施氮水平,即分别施用0、150和300 kg/ha尿素,于伸长期取叶片样品分析叶绿素相对含量(SPAD)、叶面积、比叶重和叶绿体超微结构,并测定光合速率。【结果】3个甘蔗品种叶片的SPAD和叶面积均随施氮水平的增加而增加。GT11和ROC22的比叶重随施氮量的增加显著降低(P<0.05,下同),GXB9的比叶重在中氮水平最低。GT11在高氮水平下叶绿体超微结构正常;ROC22在中氮水平下叶绿体数量最多,但基粒片层数量显著少于高氮水平;GXB9在中氮水平下叶绿体数量最多,基粒片层与高氮水平时无明显差异。GT11和ROC22的净光合速率随施氮水平的增加而增加,GXB9净光合速率在中氮水平最高。【结论】甘蔗光合速率与叶绿体数量、叶绿体超微结构及基粒片层数量密切相关,且均受甘蔗品种和施氮量的共同影响。

巴西甘蔗糖业高效低耗的经验与启示

巴西目前拥有432家糖厂和酒精厂,其中251家既生产糖也生产酒精,162家只生产酒精,19家只生产糖。巴西的蔗糖酒精产业是一种集约型的产业模式,土地集中度高,70%的甘蔗种植土地属于糖和酒精生产企业,工农业利益一体化。巴西的甘蔗育种选择目标是单位面积产糖量最高,并且宿根性强。甘蔗酒精发酵液100%定量还田技术,蔗叶也全部还田,不仅实现了零排放,消除了环境污染,而且为甘蔗生长提供了全面而充足的养分,加上甘蔗生物固氮特性的利用,其在甘蔗生产上的化肥使用量很低,施氮量约60~100kg/hm^2,仅相当于目前我国的常规施肥量10%或更少,再加上宿根年限长,甘蔗生产全程机械化,所以甘蔗生产成本低。其经验值得我们借鉴。

甘蔗品种ROC22组织培养体系中G418的浓度筛选

以甘蔗品种ROC22茎尖组织为材料,在组织培养的各个阶段,设定添加G418的浓度梯度进行筛选,找出甘蔗品种ROC22遗传转化体系建立的组织培养每个阶段最佳的G418浓度,为应用遗传转化改良甘蔗品种提供参考依据。研究发现,甘蔗品种ROC22茎尖愈伤组织生长、分化、小苗生根阶段的最佳G418浓度分别为20 mg/L、40mg/L、30 mg/L。≤20mg/L浓度的G418能促进甘蔗分化,当G418达到一定浓度甘蔗不能生长,因此G418可用于筛选带有其抗性的植株。

转SoSUT5基因甘蔗的生长特性

【目的】研究甘蔗蔗糖转运蛋白So SUT5基因对甘蔗主要农艺性状和相关生理生化特性的影响,为评价转基因甘蔗的生长情况及验证So SUT5基因的功能提供参考。【方法】通过PCR扩增和测序验证6个转So SUT5基因甘蔗品系(T1、T2、T3、T6、T9和T11),以野生型甘蔗B8植株为对照,在苗期、分蘖期、伸长期和成熟期分别测定甘蔗的株高、茎径、叶绿素相对含量和+1叶叶面积,成熟期时测定蔗茎的可溶性糖含量。【结果】通过PCR扩增测序获得6个转So SUT5基因甘蔗品系的目的基因序列,表明导入的So SUT5基因已整合到甘蔗基因组DNA中。除T6外,其他5个转基因甘蔗品系的株高、茎径和+1叶叶面积均高于对照,其中成熟期时5个转基因甘蔗品系的茎径和+1叶叶面积均显著高于对照(P<0.05,下同),T1、T2和T9的株高及T1、T2和T11的叶绿素相对含量显著高于对照。成熟期时6个转So SUT5基因甘蔗品系的可溶性总糖含量均高于对照,其中T2、T9和T11的可溶性总糖含量极显著高于对照(P<0.01),分别比对照高40.3%、40.3%和33.4%。【结论】So SUT5基因在甘蔗中过表达可促进甘蔗生长,并可提高蔗茎的可溶性总糖含量。由此推测,该基因可能与甘蔗节间糖分积累有关,且对甘蔗生长起促进作用。

甘蔗细胞壁转化酶基因(SoCIN1)克隆及其在转基因烟草中的表达特性分析

【目的】克隆甘蔗细胞壁转化酶基因(So CIN1)并分析其在转基因烟草植株中的表达特性,为研究CIN1基因功能提供参考。【方法】克隆So CIN1基因,利用基因重组技术构建植物正义表达载体p BI121-So CIN1,采用叶盘法经农杆菌EHA105介导将其转化烟草品种K346。经抗性筛选和PCR扩增验证后获得转So CIN1基因烟草植株,采用半定量PCR检测叶片So CIN1基因的表达量,并测定叶片可溶性糖含量、CIN活性及株高(以野生型烟草为对照)。【结果】克隆获得的So CIN1基因长度为1731 bp,与Gen Bank已公布的So CIN1基因(JQ312298)核苷酸序列同源性达100%,并通过构建其植物正义表达载体转化烟草。PCR扩增鉴定结果表明,So CIN1基因已整合至烟草基因组DNA。对F0和F1代进行转基因烟草连续筛选,获得4个转So CIN1基因烟草株系(T-1、T-2、T-3和T-4)。在4个株系的叶片中均检测到So CIN1基因的表达,其中以在T-1株系叶片中So CIN1基因表达量最高,其次是T-3株系,最低的是T-4株系。4个株系叶片的可溶性糖含量、CIN活性及株高均高于野生型烟草,其中CIN活性显著高于野生型烟草(P<0.05,下同),且T-1株系CIN活性高于其他3株系;T-1、T-2和T-3株系叶片可溶性糖含量分别显著高于野生型烟草39.68%、19.95%和31.15%;T-1、T-2、T-3和T-4株系的株高较野生型烟草分别提高了15.57%、2.90%、5.74%和5.22%,但仅T-1株系与野生型烟草存在极显著差异(P<0.01)。【结论】转So CIN1基因烟草叶片过表达So CIN1基因,能提高烟草的CIN活性和可溶性糖含量,促进植株生长,由此推测该基因在甘蔗生长发育和蔗糖积累过程发挥作用。

ATP-柠檬酸裂解酶研究进展

文章从亚细胞定位、结构、酶学活性、作用机制、功能等方面介绍了近年来ATP-柠檬酸裂解酶(ACL)的研究进展。ACL酶的结构复杂,不同的生物体中其结构不同;研究发现,随着进化的发生,该酶的两个异源结构有向同源结构方向发展的趋势。ATP-柠檬酸裂解酶在生物体中发挥重要的作用,如:生成胞间乙酰-CoA、作为脂肪酸合成的调控酶、提高植物抗逆性、参与有性生殖的调节等。近年来,对ACL的研究主要集中在酶学活性上,发现其能提高油菜的产油量和抗旱性。今后可对各种作物的ACL功能及开发利用进行深入研究,尤其在提高作物产油量和抗旱性方面应加大研究力度,提高产油作物的产油量、增强作物对干旱环境的抵抗力;此外,利用不断发展的基因组学、蛋白质组学和宏基因组学等现代分子生物学技术和先进、有效的手段,深入发掘ACL的潜在功能,扩大ACL在各个领域的应用。

宿根矮化病菌对甘蔗品质及茎、叶超微结构的影响

甘蔗宿根矮化病(Ratoon Stunting Disease,RSD)是由Leifsonia xyli subsp.xyli(Lxx)引起的,是目前世界所有植蔗地区危害性极大的病害之一。本实验以甘蔗品种新台糖22号(ROC22)健康植株为对照,感染RSD植株为处理,观察和测定RSD侵染甘蔗引起的蔗株农艺性状、蔗糖分以及茎、叶超微结构的变化。结果表明:(1)感染RSD种茎的出苗率比对照减少2.94个百分点;株高比对照下降28.85 cm;茎径比对照减少0.28 cm;节间长度比对照减短3.50 cm;单茎重比对照低0.36kg。(2)感染RSD植株的蔗糖分低于对照0.9个百分点(绝对值)。(3)利用透射电镜技术对感染RSD植株茎、叶细胞超微结构进行观察表明,叶片叶肉细胞、维管束鞘细胞及茎细胞内的细胞器及细胞核都发生了明显的病理变化。与健康叶片相比,叶绿体变形,叶绿体基质片层大部分消解,基粒结构消失,叶绿体外膜和内膜剥离。线粒体形态异常,有的肿大、内嵴模糊,严重者内嵴消失并空泡化,仅剩未被消解的残骸;细胞核形态变为不规则,核膜破裂,染色质分布不均匀,呈降解状态。在感染RSD甘蔗茎维管束导管细胞内积累有大量的电子致密物质,细胞壁有不同程度的溶解和断裂,这可能和RSD病原细菌侵染有关。以上结果表明:RSD侵染甘蔗后,可能导致光合效率下降,对水分和营养物质的运输能力降低,从而导致甘蔗品质和产量的降低。

甘蔗转化酶抑制子(SoInvInh1)基因克隆和表达分析

采用cDNA末端快速克隆(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术,以甘蔗未成熟茎cDNA为模板克隆转化酶抑制子,命名为SoInvInh1,GenBank登录号KF575175。SoInvInh1基因的cDNA序列全长为678bp,3′-UTR长146bp。开放阅读框长531bp,编码176个氨基酸,预测分子质量和等电点分别为18.09ku和8.52。SoInvInh1不含内含子序列。预测该蛋白N端具有1个信号肽和跨膜结构,19—172位氨基酸是PMEI蛋白的保守结构域。不同物种间InvInh蛋白氨基酸序列同源性较低,但都具有4个保守的Cys位点。荧光定量PCR分析表明在甘蔗茎、叶、花序和花序轴中都能检测到SoInvInh1基因表达。在甘蔗生长的不同时期,SoInvInh1在叶中表达无明显规律。而在工艺成熟期和生理成熟前期SoInvInh1整体上表现为幼茎中基因表达量高,而老茎中基因表达量低,表明茎中该基因可能与酸性转化酶活性相关。

甘蔗蔗糖转运蛋白SoSUT2基因克隆和表达分析

为分析甘蔗SUT家族基因新成员的序列特征和基因表达模式,采用cDNA末端快速克隆技术,以甘蔗GT28未成熟茎cDNA为模板克隆蔗糖转运蛋白基因,命名为SoSUT2-h1,GenBank登录号KF808330。该基因的cDNA序列全长为2 132bp,开放阅读框长1 749bp,编码582个氨基酸,预测分子量和等电点分别为61.80ku和6.17。SoSUT2-h1蛋白具有12个跨膜结构。该蛋白具有保守的蔗糖转运蛋白功能域,属于MFS蛋白家族和GPH(蔗糖/H+共转运体)超家族中的一员。荧光定量PCR表明在甘蔗叶、花序、芽、茎和根中都能检测到SoSUT2基因表达,其中在芽中表达量最高,花序次之,而在根中表达量最低。在甘蔗工艺成熟期,SoSUT2基因表达量与节间蔗糖含量呈正相关性,推测该基因可能参与调控甘蔗节间蔗糖的积累。

甘蔗光合系统Ⅰ psaD 基因的克隆和表达分析

采用RACE-PCR方法,以甘蔗心叶为材料克隆了甘蔗PS Ⅰ反应中心亚基Ⅱ基因全长,命名为SopsaD,GenBank登录号JX866950.该基因cDNA序列全长为904 bp,编码200个氨基酸多肽,预测其分子质量和等电点分别为21.85 ku和10.5,其中N端的1～44 aa是叶绿体转运肽序列,62～199 aa是保守的Pfam:PasD结构域.SopsaD与玉米(EU953246)、水稻(AY224449)、大麦(M98254)和短柄草(XM003564060) psaD基因核苷酸同源性分别为85％、85％、84％和81％,氨基酸序列的同源性分别为92％、88％、87％和85％.荧光定量PCR表明甘蔗在叶、花序、芽、茎和根中都能检测到SopsaD基因表达,其中在叶中表达量最高,其次是花序中,而在根中的表达量最低.甘蔗在工艺成熟期和生理成熟期SopsaD基因整体上表现为功能叶中基因表达量高,而老叶中基因表达量低,证实该基因参与光合作用反应.

Trizol试剂法快速高效提取3种作物不同组织总RNA

【目的】建立适用于禾本科作物不同组织总RNA的快速、高效提取方法,为进行后续的分子生物学研究奠定基础。【方法】采用Trizol试剂法,通过改变抽提上清液吸取量、沉淀方法及沉淀漂洗次数,对甘蔗、玉米和水稻的叶片、茎尖和根尖的总RNA提取方法进行优化。【结果】与吸取0.4mL上清液相比,吸取0.2mL上清液的总RNA OD260/OD280、OD260/OD230值分别在1.95～2.00和2.11～2.44,所获得的总RNA纯度较高。沉淀漂洗两次的OD260/OD230值(2.11～2.47)明显高于沉淀漂洗1次的总RNA OD260/OD230值(1.01～1.61),总RNA纯度较高。经异丙醇沉淀所得的各材料的总RNA28S、18S和5S谱带清晰,无拖尾现象,总RNA完整性较好;LiCl沉淀法的RNA条带较模糊粘连,5S条带明显弥散,总RNA产率相对较低。以Trizol-异丙醇法提取的甘蔗总RNA为模板进行GAPDH基因片段扩增,所获甘蔗的叶片、茎尖和根尖的GAPDH基因表达丰度很强,无特异扩增,目的片段长度为153bp。【结论】改良Trizol-异丙醇法提取甘蔗、玉米和水稻不同组织的总RNA带型清晰、完整性好、纯度和产率高,适用于快速、高效提取禾本科植物不同组织总RNA。