应用B.t.和SBTi基因提高水稻抗虫性的研究

利用基因枪法将单个B .t.基因或与SBTi基因一起导入到两个华南地区优良籼稻品种中 ,获得 2 1个转B .t.单基因的植株系 ,4个转B .t.和SBTi双基因的植株系。对R1代植株的分子杂交和遗传分析表明 ,3个转双基因系中多个拷贝的B .t.和SBTi基因均是整合在植株基因组同一染色体上相同或相近位点。Northernblot证明在R2 代转基因植株中B .t .基因稳定表达。对稻纵卷叶螟的抗性实验表明 ,转B .t .单基因或B .t.和SBTi双基因的转基因植株均较原种对照有更强的抗性 ,而转双基因植株较转单基因植株又有更强的抗性。

获得高抗虫转双基因烟草

利用DNA合成仪人工合成了豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)的cDNA编码全序列。合成的基因经过克隆和序列分析后,克隆到植物高效表达载体上,并转化农杆菌,通过共转化的方法,将CpTI基因和经人工改造的苏云金芽孢杆菌(B.t)δ-内毒素基因共转化烟草,得到经PCR扩增并Southern-blotting验证的分别含有CpTI和B.t基因的植株以及同时含有CpTI和B.t基因的植株。利用棉铃虫幼虫进行的杀虫测试表明,转基因烟草和对照烟草相比具有明显的杀虫活性,同时转双基因的烟草和转单一基因的烟草相比具有增强的杀虫活性。

苏云金杆菌δ-内毒素基因及3′末端缺失基因在大肠杆菌和农杆菌中的亚克隆和表达

苏云金芽孢杆菌变种Bacillus thuringiensis aizawai 7-29 δ-内毒素基因及其3′末端缺失基因,亚克隆到质粒pUC19上,构建了pUCF33和pUCK63重组质粒。进一步将δ-内毒素基因及其3′端缺失基因,插入到植物表达载体pBI121.2质粒中,构建了pGY61和pGYCK63重组质粒。用^(32)中标记的δ-内毒素3′末端缺失的Kpn I DNA片段的探针,与重组质粒进行DNA-DNA分子杂交,结果阳性。带有全长和3′末端缺失重组质粒,转入大肠杆菌HB101和农杆菌LA4404受体细胞中,其克隆子细胞抽提物,对大菜粉蝶和玉米螟幼虫均具有杀虫生物活性。结果证明δ-内毒素基因不仅能在大肠杆菌HB101中,而且能在农杆菌LA4404中表达。

植物抗体基因工程：I．分泌马铃薯Y病毒中和抗体杂交瘤细胞系的筛选

酶联免疫吸附试验证实，Ｄ７３、Ｄ９０和Ａ６９三个杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体均能够与马铃薯Ｙ病毒株系ＰＶＹ￣ｏ、ＰＶＹ￣Ｎ和ＰＶＹ￣ｃ发生反应，但以Ｄ７３的亲和性为最强。进而进行的侵染抑制试验也证实经Ｄ７３单克隆抗体处理后的病毒接种物，其在‘Ａ６’（ＳｏｌａｎｕｍｄｅｍｉｓｓｕｍｘＳ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）离休叶片引起枯斑的能力显著地受到抑制。因此，选用Ｄ７３杂交瘤细胞系作为分离马铃薯Ｙ病毒中和抗体基因的材料，对其分泌的抗体轻链和重链的亚类进行鉴定，结果发现组成该单克隆抗体分子的轻链和重链分别为Ｋ链（ｋａｐｐａ）和γ＿１链。

植物抗体基因工程：II．马铃薯Y病毒中和抗体cDNA基因文库的构建及含抗体轻链和重链基因阳性克隆的筛选

从大量繁殖的Ｄ７３杂交瘤细胞中提取制备其基因组ｍＲＮＡ，并以此为模板，经反转录途径获得基因组ｃＤＮＡ，随后将其插入到λｇｔ１１中，构建了马铃薯Ｙ病毒小鼠单克隆抗体ｃＤＮＡ基因文库。经免疫原位杂交，从该基因文库中筛选出３０个含抗体轻链基因和１０个含抗体重链基因的阳性克隆，进一步将其插入到ｎＧＥＭ－７Ｚ（＋）质粒中，经酶切分析和电泳检测，证实在获得的轻链和重链阳性克隆中各有一个质粒（Ｋ６和Ｇ９）具有较长的外源ＤＮＡ插入（分别为１Ｋｂ和１．６Ｋｂ），它们可能编码完整的抗体轻链和重链蛋白。

植物抗体基因工程：Ⅲ．马铃薯Y病毒小鼠中和抗体链基因的序列分析及其植物表达载体的构建

序列分析表明，马铃薯Ｙ病毒小鼠中和抗体轻链基因（Ｋ６）全长为９５６个核苷酸碱基（不包括ｐｏｌｙ（Ａ）尾巴），其中包括５＇端非编码区３１个核苷酸碱基，编码轻链信号肽的５７个核苷酸碱基，编码成熟蛋白的６５７个核苷酸基和３＇端非编码区的２１１个核苷酸碱基。与已知的其它Ｋ轻链基因（ＭＲＫ１６）相比，核苷酸的序列同源性为９８．７％，由核苷酸序列所推导出的氨基酸序列同源性为９７．０％，其变异主要发生在三个抗原识别位点内（ＣＯＲ）。将完整的抗体轻链基因正向插入植物表达载体ｐＢ１２１中的原ＧＵＳ基因位置上，置于花椰菜花叶病毒３５Ｇ启动子控制之下，获得了能够在植物细胞内表达马铃薯Ｙ病毒中和抗体轻链基因的植物表达载体ｐＹＬ。

植物抗体基因工程：Ⅳ．马铃薯Y病毒小鼠中和抗体重链基因的序列分析及其植物表达

序列分析表明，马铃薯Ｙ病毒小鼠中和抗体重链基因（Ｇ９）全长为１５０５个核苷酸碱基（不包括Ｐｏｌｙ（Ａ）尾巴），其中包括５＇端非编码区１６个核苷酸碱基、编码重链信号肽的５７个核苷酸碱基、编码成熟蛋白的１３２９个核苷酸碱基和３＇端非编码区的１０３个核苷酸碱基。与已知的小鼠抗体Ｍｏｐｃ２１的重链基因（γ１）相比，核苷酸的序列同源性为９４．４％，由核苷酸序列所推导出的氨基酸序列同源性为９２．６％，其中可变区内（ＶＨ）的氨基酸序列同源性达７４．５％，这表明二者起源于同一种系基因。将完整的抗体重链基因正向插入植物表达载体ｐＢⅠ１２１中的原ＧＵＳ基因位置上，置于花椰莱花叶病毒３５Ｓ启动子控制之下，获得了能够在植物细胞内表达马铃薯Ｙ病毒中和抗体重链基因的植物表达载体ｐＹＨ。

蕃茄蛋白酶抑制剂Ⅱ_a、Ⅱ_b的分离纯化及性质研究

经硫酸铵分级、CM-纤维素柱层析和Sephadex G-75柱层析,从野生型秘鲁蕃茄未成熟果实的匀浆液中分离纯化了蛋白酶抑制剂Ⅱa、Ⅱb。纯化的蛋白酶抑制剂经SDS-PAGE鉴定呈单一带,分子量均为17kD。Western blotting结果表明蛋白酶抑制剂Ⅱa、Ⅱb均与马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ有血清学上的交叉反应。抑制蛋白酶活性测定显示两种蛋白酶抑制剂都表现強的抑制胰凝乳蛋白酶的活性,但对胰蛋白酶的抑制活性蛋白酶抑制剂Ⅱb強于蛋白酶抑制剂Ⅱa。

苏云金芽孢杆菌和大肠杆菌穿梭质粒的构建和特性研究

将苏云金芽孢杆菌中的pHTA1030质粒与大肠杆菌中的pJH101质粒重组后,构建出pBHGA重组质粒。此质粒通过逐步酶切,缺失后重组得到了14个分子量大小不同的衍生重组质粒。经过对pBHG1重组穿梭质粒在E.coli HB101和B.subttlis 168受体中表达的分析,证明了它带有B.thuringiensis(简写作B.t.)质粒的启动区、启始复制区和对热分离稳定区基因片段,并能高频转化B.t.受体细胞和高表达外源cat基因,同时具有对热分离稳定的特性。为B.t.基因工程体系提供了高效转化表达载体。

我国高效杀蚊球形芽孢杆菌BS10的43kd毒素蛋白基因的定位

从国内高效杀蚊球形芽孢杆菌BS10的质粒pFWI,克隆杀蚊毒素基因的～1.4kb Hind Ⅲ DNA片段,在大肠杆菌表达杀蚊幼虫活性的43kd毒素蛋白,首次为球形芽孢杆菌杀蚊毒素基因定位在质粒上提供了直接证据。通过Southern blot和Western blot对10株BS无杀蚊活性菌株进行分析,揭示出无毒株为杀蚊毒素基因缺失突变株,这是从基因及蛋白质水平对杀蚊和不杀蚊球形芽孢杆菌的区别的首次报道。本文得到的pFL109克隆可作为探针区分杀蚊和不杀蚊球形芽孢杆菌,具有应用价值。

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)杀虫晶体蛋白基因导入棉花获得转基因植株

苏云金芽孢杆菌的两个变种中B.t.aizawai 7-29和B.t.kurstaki HD-1是毒杀棉铃虫、红铃虫等鳞翅目害虫的优良菌株.本文通过花粉管途径将B.t.aizawai 7-29和 B.t.kurstaki HD-1的杀虫基因分别导入我国棉花品种(无毒棉、中棉12, 3118,3414)中,经Dot blotting证明,有3株棉花(A1,A2, A5)带有B.t.aizawai 7-29的杀虫基因,18株棉花(B1-4,B6, B7,B9-15,B17—21)带有B.t.kurstaki HD-1的杀虫基因.取2株点杂交呈阳性的植株(A1,A2,)进行Southern blotting,结果表明,A1和A2植物DNA经Hind Ⅲ酶切后均出现了杀虫晶体蛋白基因片段,没有酶切的A1植株DNA在50kb处具有杂交性,表明杀虫基因均已整合到棉花基因组中.组织化学法检测的结果证明,与aizawai 7-29杀虫基因融合的GUS基因(二者共用1个CaMV 35S启动子和1个终止子.)在棉花(A1,A2)中得到了表达,为杀虫基因在转基因棉花中的表达提供了证据.

植物组织中胞间连丝相关蛋白的研究

动物组织中的间隙连接和植物的胞间连丝是维系生物整体性的主要结构,它们对控制和协调细胞增殖、组织代谢及其同步活动具有重要的作用.尽管它们在结构上差异很大,但是却有类似的功能.目前间隙连接的研究已较深入,而植物胞间连丝的研究则相对落后,对其生化组分的研究尚处于起始阶段.本研究以动物间隙连接蛋白的抗体为探针,试图用分子杂交及生物化学技术来确定植物中是否有与动物间隙连接蛋白家族成员同源的蛋白质存在,及其与胞间连丝的关系.