茶树己糖激酶基因CsHXK2的启动子克隆及表达特性分析

植物己糖激酶是双功能蛋白,具有磷酸化己糖和介导糖信号的关键性作用。前期研究中,我们从茶树中克隆获得4个己糖激酶基因,其中CsHXK2基因编码492个氨基酸残基,与拟南芥AtHXK3、番茄LeHXK4归为Type A类HXKs。利用RT-PCR技术,克隆获得长度为2029 bp的CsHXK2基因启动子。CsHXK2基因可能受到光照、低温、病原菌、糖和多种激素等信号的调控,且可能特异性表达于叶、花、种子、根系、腋芽等组织。CsHXK2蛋白定位于叶绿体内。酵母突变体功能互补试验表明,去除叶绿体转运信号肽的CsHXK2成熟蛋白具有葡萄糖和果糖磷酸化活性。茶树组织特异性表达分析显示,CsHXK2基因在根和茎中表达量最高,而在老叶中表达量最低。CsHXK2基因的表达受低温胁迫而显著下调,经炭疽菌侵染的茶树叶片内CsHXK2基因的表达也受到显著抑制,而外源赤霉素(GA3)处理的茶树叶片内CsHXK2基因表达显著上调。本研究结果表明,CsHXK2基因在茶树的生长发育过程和逆境胁迫响应中发挥重要的调控作用。

茶树钙依赖性蛋白激酶基因CsCDPK17的鉴定及表达分析

钙依赖型蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinases,CDPKs或CPKs)是植物细胞中重要的钙离子信号受体,普遍参与了植物生长发育和胁迫响应等调控过程。本研究从茶树龙井43中克隆到1条CDPK基因,经测序验证该序列包含1611bp的完整ORF,编码536个氨基酸。结合序列比对和进化分析发现该蛋白N-末端具有豆蔻酰化位点,具备钙依赖性蛋白激酶的保守结构域,并且与拟南芥AtCDPK17的同源关系最近,因此命名为CsCDPK17(Genbank登录号为:MK238482)。蛋白质理化特性分析发现其蛋白分子量为59.9kD,理论等电点pI为5.43,属无跨膜结构域的亲水性蛋白。使用水稻原生质体和烟草叶片两种瞬时表达的方法均证明CsCDPK17是细胞质膜和细胞核双定位蛋白。对克隆到的CsCDPK17上游2000bp的启动子区分析发现了多个与基因转录、光、激素(ABA、SA、MeJA等)相关的顺式作用元件。表达分析显示,CsCDPK17在成熟叶和种子中表达水平较高,而在根中的表达水平最低;在龙井43、大面白等4个品种冷驯化过程中,该基因的表达随着冷驯化过程显著上调,随着脱驯化过程下调;同时还发现CsCDPK17能够不同程度地响应低温(最高5.1倍)、干旱(最高2.3倍)、渗透(最高2.4倍)胁迫。本研究的结果表明CsCDPK17在茶树的生长发育和低温、干旱、渗透等非生物胁迫响应的过程中均发挥一定的调控作用。

茶树CsCIPK12与CsKIN10的互作鉴定及其表达分析

蔗糖非酵解-1相关蛋白激酶(Sucrose non-fermenting 1-related protein kinase,SnRK)在代谢调控和胁迫信号传递中发挥重要的作用。本文以茶树SnRK3亚家族的CsCIPK12基因和SnRK1亚家族的CsKIN10基因为研究对象,通过序列比对和进化分析,发现CsCIPK12和CsKIN10都具有N端激酶结构域和C端调节域;CsCIPK12具有与CBLs结合的NAF/FISL结构域,与拟南芥AtCIPK12,杨树PtCIPK17、18、19同源关系最近;而CsKIN10具有泛素相关的UBA结构域,与杨树PtSnRK1同源关系最近。通过酵母双杂交系统,证实了CsCIPK12和CsKIN10蛋白存在相互作用。表达分析发现,在自然冷驯化过程中,CsKIN10的表达模式与前期对CsCIPK12的研究结果一致,在龙井43、浙农12、大面白3个茶树品种中受低温不同程度地诱导;4℃短时低温处理发现,CsCIPK12和CsKIN10在成熟叶中受低温显著诱导(最高诱导水平分别为4倍和2.3倍),而在新梢中,二者对低温的响应并不显著;ABA、葡萄糖以及蔗糖处理发现,CsCIPK12和CsKIN10在成熟叶中受这3种处理的显著诱导。结果表明,CsCIPK12与CsKIN10蛋白相互作用,参与ABA和糖信号途径,在茶树低温胁迫响应中可能发挥重要作用。

茶树DNA去甲基化酶基因的全基因组鉴定及表达分析

DNA去甲基化酶(dMTase)是主动去甲基化过程中具有糖基化酶和脱嘌呤裂合酶活性的双功能酶。基于茶树基因组数据,本研究利用生物信息学方法对茶树DNA去甲基化酶(CsdMTase)编码基因进行了全面鉴定和序列分析。全基因组鉴定结果表明,舒茶早基因组中包含4个CsdMTases,系统进化分析将CsdMTases分为DME和ROS两个分支,基因结构分析显示不同成员之间的基因序列长度和内含子数量存在差异。不同CsdMTases蛋白的理化性质相似,均包含ENDO3c和RRM_DME典型的保守结构域,且都定位在细胞核中。CsdMTases家族基因启动子区域包含大量光信号响应、植物激素响应、胁迫响应和生长发育等相关顺式作用元件。表达分析结果显示,CsdMTase基因在不同组织器官中均有表达,有一定的组织特异性;在炭疽菌(Colletotrichum camelliae)、拟盘多毛孢菌(Pseudopestalotiopsis camelliae-sinensis)和茶尺蠖(Ectropis oblique)等生物胁迫及干旱等非生物胁迫下,CsdMTase的表达均被显著诱导;冬季休眠过程中CsdMTases在不同品种成熟叶和越冬芽中的表达模式存在显著差异;CsDMEa、CsDMEb在花芽发育及种子萌发的不同阶段的表达存在显著上调过程。CsdMTases介导的主动去甲基化过程在调控茶树胁迫应答和生长发育中可能发挥了重要的作用,为深入揭示茶树表观调控机制提供理论依据。

萌芽前叶面喷施硒酸钠提高茶叶含硒量及品质

【目的】探究在茶树不同生育时期叶面喷施不同硒肥对夏茶产量、品质及硒含量的影响,为生产富硒茶提供技术依据。【方法】田间试验在浙江嵊州进行,供试茶树品种为‘中茶108’。试验采用二因素列区设计,主处理为硒肥种类(A因素),副处理为硒肥喷施时期(B因素)。主处理设喷施清水对照(A0)、硒酸钠(A1)、亚硒酸钠(A2)和酵母硒(A3);副处理设夏茶顶芽萌发前(5月12日,B1)与1芽1叶期(5月20日,B2)两个喷施时期。硒肥喷施浓度均为Se 50 mg/L,硒肥溶液喷施量为1.8 L/m^(2)。当茶树蓬面1芽2叶占比达30%左右时,每个小区随机选取30 cm×30 cm茶蓬,调查蓬面新梢总数、1芽2叶数量、1芽2叶长度和百芽重。同时,取1芽2叶新梢样品,测定茶多酚、儿茶素、咖啡碱、游离氨基酸、花青素以及硒含量。【结果】与A0B1处理相比,A3B1处理茶树萌展值显著降低了0.14,但对茶树蓬面新梢总数无明显影响;A2B1处理茶树1芽2叶新梢长度和百芽重分别显著降低了1.04 cm和1.94 g。A1B2和A3B2处理茶树蓬面新梢总数分别显著降低了17.66和22.33,但不影响其萌展值;A1B2显著降低茶树1芽2叶新梢长度和百芽重,分别降低0.88 cm和1.70 g。A1B1和A2B1处理的茶叶总硒含量分别显著提高了1.15和1.47 mg/kg,有机硒含量分别显著提高了1.13和1.38 mg/kg,但A3B1处理未显著提高茶叶硒含量。A1B2、A2B2和A3B2处理均显著提高了茶叶总硒和有机硒含量,其中总硒增加量分别为5.97、7.88和2.61 mg/kg,有机硒含量分别增加了5.17、7.51和2.48 mg/kg。另外,A1B1显著降低了茶叶咖啡碱、没食子酸和儿茶素含量;A1B2处理显著降低了茶叶游离氨基酸含量,但显著增加了茶多酚和儿茶素总量,儿茶素组成中的没食子酸、表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯等酯型儿茶素显著增加。【结论】夏茶萌芽前喷施外源硒能够提高茶叶总硒和有机硒含量,改善茶叶品质,尤以硒酸钠的效果最好。

基于UPLC技术解析金萱×紫娟F1分离群体代谢物的遗传变异

为创制高甲基化儿茶素茶树新种质,以金萱和紫娟为亲本构建了一个F_(1)代分离群体,并通过建立一种超高效液相色谱法,对群体内各单株的代谢物含量及其遗传变异情况进行分析。研究发现,群体中多数代谢物含量分布符合正态偏陡分布,变异系数在20%~30%,且均存在一定数量的超亲个体,并从中筛选出9份高甲基化儿茶素等富含功能成分的优异单株。同时,结果显示多数代谢物含量在秋季高于春季,且儿茶素总量随叶片紫化程度加深而减少。本研究建立的超高效液相色谱法,为今后鉴定和筛选优异茶树种质资源和育种材料提供了一种更高效的测定方法;对金萱×紫娟F_(1)分离群体生化组分的遗传变异研究也为今后高功能成分育种和通过正向遗传学发掘调控相关性状的基因提供了重要基础。