黄瓜果实维生素C合成关键基因克隆与分析

【目的】鉴定调控黄瓜果实中L-半乳糖途径维生素C(Vc)合成相关基因的位置、数量及表达特征,同时对关键基因进行克隆分析,旨在为黄瓜果实中Vc合成调控研究奠定基础。【方法】根据已报道的拟南芥中L-半乳糖途径合成Vc相关基因,利用蛋白编码的氨基酸序列在黄瓜9930_V2参考基因组数据库中进行BLAST比对,确定黄瓜中的同源基因,借助TBtools软件绘制基因在染色体上的位置。通过qRT-PCR分析上述基因在果实Vc含量差异显著的两份黄瓜材料中的表达量。利用PCR扩增对限速酶GDP-L-半乳糖磷酸化酶(GGP)及GDP-甘露糖-3′5′-差向酶(GME)同源基因进行克隆,测序分析这些基因在高Vc含量与低Vc含量黄瓜果实中的序列差异。构建系统进化树,分析黄瓜果实GME、GGP与其他物种中同源基因的亲缘关系。【结果】在黄瓜基因组中比对到21个参与L-半乳糖途径合成Vc相关酶PMI、PMM、GMPase、GME、GGP、GPP、GalDH、GalLDH的同源基因,7条染色体均有分布,在5号染色体和1号染色体上分布最多。通过对21个基因在两份果实Vc含量高低差异显著的两份材料CG45(高Vc含量)和R48(低Vc含量)的表达量分析,发现调控PMI、PMM、GMPase、GME、GalLDH这5个酶的基因在CG45和R48中有极显著的表达差异。对Vc合成限速酶GGP和GME相关基因在CG45和R48两份材料中进行克隆发现,CsGME2在R48中基因全长为3537 bp,在CG45中基因全长为3541 bp,该基因在两份材料存在多个SNP位点差异和Indel差异,有一个突变位点位于CDS区,且导致了氨基酸序列的改变。通过对调控Vc合成限速酶GME、GGP蛋白性质分析,发现限速酶GME、GGP在不同物种的蛋白性质差异不大,均为亲水性蛋白,功能相对保守。进化树分析发现不同物种亲缘关系较近的聚类在一起,进化过程高度保守。【结论】鉴定出21个分布于7条染色体上的黄瓜果实Vc合成的L-半乳糖途径相关基因,推测关键酶PMI、PMM、GMPase、GME、GalLDH、GGP可能影响黄瓜果实中Vc含量变化,调控Vc合成限速步骤关键酶GME、GGP功能相对保守,Vc合成限速步骤关键酶GME基因CsGME2在高Vc和低Vc两份材料中的一个SNP位点变异导致氨基酸序列的变化。