家蚕2龄不眠蚕突变体的发现及遗传特性分析

在家蚕品种C603中发现了一种新的不眠蚕突变体。该突变体幼虫在2龄将眠初期体表有光泽,但进食量减少,蚕体基本不发育,且持续6~8 d仍然不能入眠和蜕皮,不能正常发育至3龄期,并终因体能耗尽陆续死亡。将该突变体命名为2龄不眠蚕（non-molting at the 2nd instar,nm2）。遗传分析显示,正常情况下发生突变体的蛾区中正常型个体与突变个体的比例约3∶1,有纯合致死现象,因此认为该突变体受1个隐性单基因控制。但是,不同季节饲养该突变系统出现的性状分离比不太稳定;与正常型品种杂交的F2、BC1F和BC1M世代其突变性状分离比率远低于25%。2龄第2天添食蜕皮激素能拯救2龄不眠蚕向正常发育转变,但不能改变不眠蚕的遗传特性。在nm2突变体检测到蜕皮激素合成相关基因cyp307a2的表达,而在与该突变体表型相似的nm-g突变体中未检测到该基因的表达,因此判断nm2是一个新的突变体,并初步推测蚕体内蜕皮激素水平低是nm2突变体产生的重要生理因素。

家蚕bmo-miR-217对核型多角体病毒(BmNPV)lef-1基因表达的调控作用

昆虫的单链小分子RNA(microRNAs)不仅通过与自身的靶基因互补进行转录后水平调控,从而参与重要的生命过程,并且还可以与病原体靶基因相互作用,在免疫防御方面发挥重要功能。给家蚕5龄眠起幼虫接种家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)后72 h,收集蚕体血淋巴提取总RNA用于高通量测序,经克隆验证获得一条由Bm NPV诱导上调表达的家蚕miRNA(bmo-miR-217),用生物信息学方法预测到bmo-miR-217对应的一个病毒靶基因为lef-1。构建bmo-miR-217及Bm NPV lef-1 3'-UTR的表达载体,并共转染家蚕卵巢培养细胞Bm N,于48 h后通过检测细胞的双荧光素酶相对活性,显示出bmo-miR-217可显著下调Bm NPV lef-1基因的表达(P<0.05)。已知lef-1是Bm NPV侵染复制的必需基因之一,因此抑制其表达是家蚕先天免疫的一种有效策略。

一种新的家蚕突变体——4龄幼虫致死突变的发现

在对家蚕品种P33的饲养过程中发现一种新的幼虫致死型突变体,其幼虫在3龄第2天就表现出体型较正常个体小,生长发育缓慢的特征,3龄期延长约2 d,4龄起蚕后极少取食,生长发育基本停滞,并于4龄第3-4天陆续死亡。将此突变体命名为4龄幼虫致死突变（lethal mutant in the fourth instar larvae,l-4i）。经遗传分析初步判断该突变体由常染色体上的一个隐性遗传基因控制,为纯合致死。该突变体可以作为解析家蚕生长发育机制的重要素材。

家蚕幼虫蜕皮前后头胸部蛋白质的差异表达分析

家蚕（Bombyx mori）属于完全变态昆虫,其幼虫需要经历3-4次入眠蜕皮才能结茧化蛹,已明确蜕皮过程受控于蚕体内蜕皮激素和保幼激素的含量,2种激素分别由位于头胸部的前胸腺和咽侧体分泌。为了从蛋白质水平解析家蚕蜕皮调控机制,应用双向电泳（2-DE）技术分别对各个龄期的将眠蚕、眠蚕和起蚕头胸部的总蛋白质进行分离,再以基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱（MALDI-TOF/TOF）对差异蛋白点进行鉴定。对各时期幼虫头胸部总蛋白质的2-DE图谱比对,共发现9个在眠期上调表达的差异蛋白点,经质谱鉴定分别为富含亮氨酸的损伤DNA结合蛋白、含有DEAD/H结构域的SWI/SNF相关的核小体重塑调节因子、精子生成相关蛋白、呼吸相关蛋白和泛素蛋白连接酶。初步推断这些差异表达蛋白不仅分别在家蚕的生理代谢、细胞凋亡、生殖发育、生长调节等生物学过程发挥作用,而且在幼虫的蜕皮过程中扮演了重要角色。

表皮蛋白BmCPR41在2龄不眠蚕突变体nm2中的表达和功能分析

家蚕(Bombyx mori)2龄不眠蚕(non-molting in the 2nd instar,nm2)突变体是从家蚕品种C603中发现的一种致死突变体,发育至2龄将眠期后不能正常入眠蜕皮,持续5~7 d后陆续死亡,图位克隆结果表明该突变体是由表皮蛋白BmCPG10突变引起的,且血淋巴中的蜕皮激素滴度显著低于野生型。蜕皮激素主要在前胸腺合成,因此本研究以nm2突变体和野生型家蚕2龄将眠蚕的前胸腺(包含第一对气管丛)为材料进行双向电泳分析,从中检测到一个表皮蛋白BmCPR41在突变体中的表达量高于野生型,组织表达谱表明BmCPR41在前胸腺的表达量远高于其他组织。通过RNAi敲低BmCPR41的表达,发现有部分家蚕推迟入眠或不入眠,蚕体重也显著低于对照组,且相关基因基于RNA-seq的表达情况与nm2突变体中的基本一致。基于上述实验结果推测BmCPR41基因在nm2突变体形成,尤其蜕皮激素信号通路上发挥重要作用。本研究结果为进一步研究nm2突变体的形成机制提供了实验证据,并可为研究蜕皮激素介导的信号通路提供理论依据。