猪δ冠状病毒RBD蛋白在昆虫细胞中的表达

为了获得具有天然构象且反应原性良好的猪δ冠状病毒((PDCoV))受体结合域(RBD)蛋白,根据PDCoV流行株CC-HN2K-02株S蛋白编码序列,筛选、设计、优化并合成其RBD段DNA序列,将其亚克隆至杆状病毒双表达载体pFastBac^(TM) Dual上,获得pFBD-PDR重组质粒。将该重组质粒转化到DH10Bac^(TM)大肠杆菌感受态细胞中,进行2轮蓝白斑筛选并进行PCR鉴定获得阳性重组杆状质粒Bacmid-PDR;通过脂质体转染SF9细胞进行病毒拯救,出现明显病变后收取上清,并在正常SF9细胞中盲传3代,获得的杆状病毒命名为rBV-PDR。利用间接免疫荧光法(IFA)和Western blot检测rBV-PDR感染昆虫细胞后的蛋白表达情况。结果:重组质粒pFBD-PDR酶切验证正确,重组杆粒Bacmid-PDR构建成功,杆状病毒中能够表达PDR蛋白且能与Sterp-tag抗体发生特异性结合,IFA鉴定出特异性红色荧光,表明本试验成功表达了PDCoV-RBD蛋白,为深入开展PDCoV抗体的制备、新型疫苗、诊断试剂研发奠定了基础。

猪流行性腹泻病毒感染小鼠血清抗体间接ELISA方法的建立

为建立检测感染小鼠血清中猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗体的方法,本研究应用PEDV受体结合区(receptor binding domain, RBD)重组蛋白作为抗原,通过探索各反应的最佳条件,并进行了该方法灵敏度、重复性、特异性分析。结果显示,最佳蛋白包被浓度为5μg/mL,待检血清稀释浓度为1∶400,孵育时间为37℃30 min,羊抗鼠IgG-HRP作为二抗,孵育条件为37℃30 min,底物显色时间为15 min。对建立的ELISA检测方法进行验证,阳性对照血清的稀释度为1∶204 800倍时OD450值仍大于临界值,批内和批间的变异系数均小于10%,对猪传染性胃肠炎病毒和猪δ冠状病毒抗体小鼠阳性血清检测均不发生交叉反应。结果表明本研究建立的小鼠血清PEDV抗体间接ELISA方法具有很好的灵敏度、重复性、特异性。为PEDV候选疫苗的小鼠血清特异性抗体检测提供了一种精准、高效的方法。

PEDV-RBD基因在昆虫杆状病毒中的表达与鉴定

受体结合域是决定病毒侵入宿主及其嗜性的关键因素。该研究目的在于获得具有天然构象且反应原性良好的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的受体结合域(receptor-binding domain,RBD)蛋白。根据PEDV S蛋白序列(GenBank登录号:AKN45969.1),设计、优化并合成其RBD部分基因序列,并将其亚克隆至杆状病毒双表达载体pFastBacTMDual上,得到了重组质粒pFBD-PER。将pFBD-PER转化到大肠杆菌DH10BacTM感受态细胞中,进行蓝白斑筛选,获得重组杆状质粒Bacmid-PER,通过脂质体转染至Sf9细胞中进行病毒拯救。转染120 h后,收取上清病毒液,盲传3代后收取Sf9细胞,利用间接免疫荧光法(IFA)及Western blot确定PEDV-RBD蛋白是否表达。结果显示,重组质粒pFBD-PER酶切验证正确,重组杆粒Bacmid-PER成功构建,杆状病毒能够表达PEDV-RBD蛋白,且能与strep tag抗体发生特异性反应。IFA鉴定出现特异性绿色荧光。结果表明,成功表达了PEDV-RBD蛋白且具有反应原性,为深入开展PEDV抗体制备、新型疫苗研发奠定基础。

表达猪δ冠状病毒S1蛋白植物乳杆菌的构建及验证

本研究拟构建猪δ冠状病毒(PDCoV)S1蛋白的重组植物乳杆菌。通过PCR方法扩增含1320信号肽和DCpep优化的PDCoV S1基因,利用无缝克隆技术将扩增片段克隆至植物乳杆菌表达载体pSIP411,并将pSIP411电转至宿主乳酸乳球菌NZ3900,扩增后提取质粒并验证,获得重组质粒NZ3900:pSIP411-PDCoV S1。将重组质粒电转入植物乳杆菌LP18,获得重组植物乳杆菌LP18:pSIP411-PDCoV S1,对诱导时间、诱导剂质量浓度、诱导温度等表达条件进行优化,以获得最佳表达条件。结果显示,成功扩增出1939 bp经过修饰和优化的目的基因PDCoV S1,成功构建了重组植物乳杆菌LP18:pSIP411-PDCoV S1。Western blot、流式细胞术、免疫荧光等检测方法表明重组蛋白能够在重组植物乳杆菌中表达,最佳表达条件:诱导时间为6 h、诱导剂质量浓度为150μg/L、诱导温度为33℃。本试验成功构建了1株高表达PDCoV S1蛋白的植物乳杆菌,为PDCoV口服候选疫苗的研制奠定基础。

植物乳杆菌LPJZ-658对产蛋后期蛋鸡生产性能、蛋品质及血清生化指标的影响

试验旨在探讨植物乳杆菌LPJZ-658对产蛋后期蛋鸡生产性能、蛋品质和血清生化指标方面的影响。试验选择产蛋后期京红1号产蛋鸡,随机分为对照组和LPJZ-658组,在每千克日粮中,试验组添加5.6 mL、3×10^(10)CFU/mL的LPJZ-658益生菌,对照组添加5.6 mL的MRS液体培养基,试验期为45 d,计算各组蛋鸡生产性能和鸡蛋品质,并对血清生化指标进行分析。结果表明:LPJZ-658组料蛋比显著降低,平均产蛋率显著提高;LPJZ-658组蛋壳厚度、蛋壳强度和蛋白高度均显著提高;电镜观察LPJZ-658组有效层显著增长、乳突层显著缩短并且蛋壳中钙的含量显著增多;LPJZ-658组蛋鸡血清中低密度脂蛋白、甘油和游离脂肪酸的含量显著降低;LPJZ-658组蛋鸡血清中孕酮和降钙素的含量显著提高。综上所述,饲料中添加LPJZ-658能显著提高产蛋后期蛋鸡的生产性能,改善鸡蛋品质和血清中脂质代谢和激素相关指标的含量。

P-PARV4全基因组克隆及序列分析

为研究广西地区猪hokovirus(PHoV)又称猪PARV4(P-PARV4)毒株流行情况和遗传进化特征,对采自广西地区猪组织样品进行检测,扩增出其中1株全基因序列,命名为YL172(GenBank登录号:KX827773)。感染率调查结果显示,广西地区成年猪P-PARV4感染率为95.0%。同源性分析结果显示,P-PARV4 YL172株全基因组与喀麦隆、欧洲、美国和中国参考株同源性为96.1%~99.3%;YL172株NS1基因与参考株同源性为97.0%~99.5%;YL172株VP2基因与参考株同源性为93.4%~99.1%。VP2遗传进化分析结果显示,P-PARV4分离株存在2个亚群,YL172株与中国参考株GX1、SH1、JSNJ处在同一进化分支,而美国参考株US-HK133与HK1则处在另一进化分支。