猪瘟病毒研究进展与防控中的几项实用技术

猪瘟是由猪瘟病毒引起的一种急性、发热性、接触性、高度传染性疾病,可引起各种年龄猪发病。世界动物卫生组织(OIE)将猪瘟列为A类16种法定传染病之一。我国早在1955年就研制成功了猪瘟兔化弱毒疫苗(HCLV),并在预防猪瘟的发生中起到了重要作用。近年来猪瘟的流行和发病出现了新的变化,如非典型性、持续性感染以及免疫失败等。当前,猪瘟仍是世界养猪业的一大威胁,造成了严重的经济损失。通过分析国内外猪瘟的发生特点,并结合国内外公开发表和学术会议交流的学术文献,总结了猪瘟病毒的分子特征、猪瘟的最新流行特点、诊断技术以及疫苗研究进展,并总结猪瘟防控中的几项实用技术,以期为猪瘟的研究与防控提供一定的参考。

重组布氏杆菌BP26蛋白和OMP31蛋白作为间接ELISA诊断抗原的研究

目的传统布氏杆菌病血清学方法因其抗原构成复杂,存在较严重的交叉免疫反应性,导致结果判定困难。BP26及OMP31分别为布氏杆菌细胞周质蛋白及外膜蛋白,在感染牛、绵羊、山羊、犬和人类均为优势免疫原,且在抗原性上具有较好的布氏杆菌种属特异性。方法以大肠杆菌表达、纯化的BP26和OMP31重组蛋白为包被抗原,初步建立了检测血清特异抗体的间接ELISA方法,并以现地牛布氏杆菌普查检测血清100份为样本,与传统的试管凝集试验进行了比较研究。结果试管凝集试验血清样本阳性率为15%(15/100);BP26包被抗原ELISA检测判为阳性的12个样本中有11为试管凝集反应阳性,相对阳性率为73.3%,二者阳性符合率为92%(11/12);而采用OMP31为包被抗原,阳性检出率为0(图5)。结论被检测区域阳性牛主要感染布氏杆菌为牛种布氏杆菌(B.abortus天然缺失OMP31基因);BP26作为间接ELISA包被抗原用于牛布氏杆菌血清学检测具有良好的特异性及较好的敏感性。

H9N2禽流感病毒中国分离株血凝素基因序列的初步分析

10株中国H9N2禽流感病毒分离株的血凝素基因分析表明 ,这些分离株间的亲缘关系较近 ,推测它们可能来源于同一种系。H9亚型分离株的HA1亚单位系统发育分析表明中国AIV分离株与 97香港禽类市场上分离到的毒株不同。中国分离株中在HA切割位点上均未见到典型的高致病力毒株H5、H7所具有的一系列碱性氨基酸 ,其排列均为_PARSSGLF_ ,系统发育分析表明该

13株新城疫病毒强毒株的分离鉴定及部分生物学特性

2004年-2005年从黑龙江省11个地区鸡场、鸽场、鹅场疑似新城疫(ND)病死鸡、鸽、鹅体内分离到24株具有血凝活性的病毒,经HA、HI试验和电镜观察证实了13株病毒为NDV。其鸡胚平均死亡时间(MDT)和1日龄雏鸡脑内接种致病指数(IC-PI)分别为36.8 h^73.6 h和1.51~2.00之间,属于NDV强毒株或中强毒株。除HLJ-12-04株外,强毒株的血凝素热稳定性较差,属快速或中速血凝解脱型;弱毒株的血凝素热稳定性好,属慢速血凝解脱型。所有毒株均可较好地凝集鸡和人(O型血)的红细胞,但对其他动物的红细胞凝集性差异较大,对马和兔的红细胞凝集无规律。

我国部分地区NDV的分子流行病学研究

新城疫（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ，ＮＤ）是由新城疫病毒（ＮＤＶ）引起的禽类的一种以呼吸道、消化道粘膜出血为典型症状的急性传染病，其病原——ＮＤＶ是副粘病毒科、副粘病毒亚科、腮腺炎病毒属的成员，为有囊膜的负链ＲＮＡ病毒。ＮＤＶ基因组为单股不分节ＲＮＡ，编码六种病毒结构蛋白，其中融合蛋白（Ｆ）和血凝素－神经氨酸酶蛋白（ＨＮ）构成囊膜外表面的纤突，是ＮＤＶ的功能性糖蛋白，在致病和免疫应答过程中起重要作用［１］。由于ＮＤＶ只有一种血清型，对ＮＤＶ不同毒株的差异性分析只能采用毒力、蚀斑形成能力测定等功能性试验来进行，但分型要么太细，无规律可循；要么过于粗放，无流行病学意义，使得ＮＤＶ流行病学研究一直难以突破。 近年来，随着分子生物学技术的广泛应用，使得人们在分子水平上对病毒遗传变异机制的研究取得了长足进展，发现病毒的遗传变异与疾病的流行有着密不可分的联系，并形成了病毒分子流行病学这样一门崭新学科，也为ＮＤ的流行病学研究提供了一种先进技术。已有研究表明，ＮＤＶＦ基因的遗传变异与ＮＤＶ的变异和流行密切相关，是ＮＤＶ分子流行病学研究的首选基因。

我国猪布鲁氏菌病流行现状及研究进展

布氏杆菌是重要的人兽共患病病原体。该病在世界各国流行广泛，严重危害人类健康和畜牧业发展，还是美国军方成功研发的第1个细菌战武器。布氏杆菌分为猪型，流产型，马耳他型，犬型，绵羊型，沙林鼠型和最近新发现的水生动物型。猪布氏杆菌在全世界多数国家的野猪和家猪中都有发生，对人也表现出高度易感性，危害也较为严重。

马传染性贫血病毒免疫学研究进展

马传染性贫血病病毒(equine infctious anemiavirus EIAV)导致马持续性感染和反复病毒血症,与人免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)同属反转录病毒科慢病毒属,二者有很多相似的特性[2].EIAV是遗传结构最简单的慢病毒,其感染的潜伏期只有几天至几周,而且在EIAV感染过程中新的抗原变异株的出现与疾病的反复发作相关,这使EIAV有可能作为研究HIV-1分子致病机理及免疫机制的动物模型[3].

传染性海绵状脑炎病原因子的研究进展

传染性海绵状脑炎病原因子是一类具有侵染性的蛋白颗粒，它对紫外线照射、电离辐射和加热处理等有极强的抵抗力，并能抗核酸酶的水解作用，但对蛋白酶较敏感。目前有四种有关该病原因子的结构理论，即：非常规病毒假说、朊病毒假说、蛋白侵染因子假说和统一学说。研究表明，ＰｒＰ在海绵状脑炎的发生及发展过程中起着关键作用。对ＰｒＰ的深入研究将为传染性海绵状脑炎的检测和免疫预防奠定基础。

猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子生物学

猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的猪的一种传染病,目前在世界各地均有发生和流行,是危害养猪业最为严重的疾病之一。PRRSV也是造成2006年以来我国猪高热病的主要病原。本文对猪繁殖与呼吸综合征病毒的病毒形态和理化特性、基因组结构、病毒蛋白及功能,基因组的变异,分子生物学诊断等五个方面的研究进展作了综述。

不同毒力马耳他种布鲁氏菌体内外诱导细胞凋亡的研究

为探究不同毒力马耳他种布鲁氏菌能否在体内外诱导凋亡以及诱导凋亡程度的差异,本研究将M28(强毒株)和M5-90(疫苗株)以MOI=100感染小鼠巨噬细胞系RAW264.7,利用激光共聚焦显微镜观察和流式细胞术检测凋亡产物caspase3/7。结果显示:M5-90和M28在体外细胞水平均能够诱导RAW264.7细胞凋亡,且M5-90促进细胞凋亡能力高于M28。然后将M28和M5-90以1×10~6 cfu的剂量接种BALB/c小鼠,分别在接种后3 d、7 d和42 d迫杀小鼠,取小鼠脾脏组织制备切片,经HE染色后进行形态学观察,利用透射电镜观察并通过Tunel法检测细胞凋亡。结果显示M5-90和M28感染后均可诱导小鼠脾脏细胞凋亡,凋亡细胞主要为T淋巴细胞。本研究为布鲁氏菌诱导宿主细胞凋亡和布鲁氏菌致病机理研究奠定了基础。

弓形虫突触融合蛋白STXQa1对虫体生长的作用研究

为揭示弓形虫突触融合蛋白STXQa1在虫体生长过程中的作用,本研究利用ddFKBP系统构建了STXQa1的条件性过表达虫株。利用间接免疫荧光试验(IFA)观察STXQa1的亚细胞定位,通过westen blot及IFA检测STXQa1蛋白的表达;经IFA检测STXQa1蛋白过表达虫株在细胞内的增殖能力、侵入细胞的能力以及逸出细胞的能力。结果显示STXQa1定位在虫体空泡样隔室(VAC);利用shield1能够快速调控ddFKBP-STXQa1融合蛋白的表达;过表达STXQa1对弓形虫的细胞内增殖具有抑制作用,同时影响弓形虫的侵入及逸出能力。本研究通过对弓形虫独特的突触融合蛋白STXQa1的表达与鉴定,为进一步研究弓形虫分泌细胞器的成熟和蛋白的分泌机制研究奠定了基础。

猪病研究新进展:第十七届国际猪病大会述评

2002年6月2～5日在美国衣阿华州立大学所在地阿姆斯市召开的第十七届国际猪病大会迎来与会代表近1700人,来自55个国家和地区,我国出席代表近20人.3名国际著名学者作了主旨演讲,15名知名学者作了典型报告,先后有175人次进行了汇报交流,共有688人次进行了海报交流.本次大会涉及新出现疾病、肠道疾病、繁殖性疾病、呼吸道疾病、细菌学、病毒学、毒物学、流行病学、病理学、诊断学、免疫学、血清学、疫苗学、疾病防治与控制、抗生素抗性、猪的保健与环境、猪肉生产与环境、工作人员与环境、遗传学、猪遗传与抗病性、养猪设施设计与管理、食品安全、肉品质量、营养、繁殖、经济学、人员管理等主题.纵观本次大会,给人最突出的印象是一个'新'字.

高纯度鸡IgA的制备与鉴定

本试验应用聚乙二醇 (PEG)粗提后 ,DEAE纤维素离子交换 ,Sepharose_4B凝胶过滤层析方法 ,从鸡胆汁分离提取IgA 。

猪细小病毒SY-99株非结构蛋白NS1基因的克隆及序列分析

猪细小病毒 (Porcineparvovirus,PPV)SY_99株由本室分离 ,提取SY_99株的基因组DNA ,利用PCR扩增出全长NS1基因 ,将该基因克隆到原核表达载体pET2 8a中并测序。结果表明 ,NS1基因全长 1989bp ,编码 6 6 2个氨基酸。氨基酸序列中含有在PPV复制过程中发挥重要作用的保守基序GKRN ,并有 3个潜在的糖基化位点 ,分别位于 35 6～ 35 9、4 4 6～ 4 4 9、5 13～ 5 16位氨基酸处。SY_99株NS1基因与其它PPV毒株NADL2_1、NADL2_2、Kresse株核苷酸同源性分别为 98%、99%、99% ,氨基酸同源性分别为 97%、99%、99%。

猪生殖-呼吸道综合征病毒CH-1a株ORF2～7序列测定

新近发现的猪生殖－呼吸道综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）是单股ＲＮＡ病毒，属于不久前成立的动脉炎病毒科。为了比较从国内分离的ＰＲＲＳＶ与欧美ＰＲＲＳＶ毒株的分子遗传学关系，本文扩增并克隆了ＰＲＲＳＶＣＨ－１ａ株ＯＲＦ２～７，测定了其核苷酸序列。用序列分析软件进行核苷酸和氨基酸序列比较分析，结果表明ＣＨ－１ａ株与欧洲型代表株ＬＶ的遗传关系较远，与北美洲型代表株ＶＲ－２３３２遗传距离最近，可能来自同一祖先。

几种表达系统的比较

随着蛋白质工程和DNA重组技术的发展 ,许多有应用潜力的蛋白分子有待开发。不同蛋白在不同系统中表达水平有显著差异 ,所以选择一种合适的表达系统对蛋白表达水平非常关键。对细菌、酵母、昆虫杆状病毒、哺乳动物细胞 4种表达体系作一概述 ,并讨论各自优缺点及常见问题。

犬瘟热病毒的结构多肽分析

差速离心和蔗糖密度梯度离心纯化经鸡胚成纤维细胞蚀斑克隆后的犬瘟热毒Ｓ＿８毒株，采用ＳＤＳ－ＰＡＥＧ电泳及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ转印技术详细分析了犬瘟热病毒的结构多肽。回收凝胶中１条６３Ｋｄ的蛋白带，经３种不同的蛋白酶消化后，首次证明在犬瘟热病结构多肽中，融合蛋白Ｆ多肽的两个亚单位（Ｆ＿１和Ｆ＿２）是以胰蛋白酶的特异性水解位点精氨酸为桥梁连接形成Ｆ多肽的。试验结果表明，犬瘟热病毒主要包括Ｌ（２００．５Ｋｄ）、ＨＡ（７４Ｋｄ）、Ｐ（６８Ｋｄ）、Ｆ（６３Ｋｄ）、ＮＰ（５６Ｋｄ）、Ｍ（３５Ｋｄ）等６条结构多肽，同时下蛋白可在电泳中裂解成Ｆ＿１（４１Ｋｄ）和Ｆ＿２（２７Ｋｄ）２个亚单位。试验还发现其它３条分子量分别为５２Ｋｄ、４４Ｋｄ、３２Ｋｄ的病毒蛋白成分，它们是否均为病毒的结构多肽仍需深入研究。

新城疫病毒F48E9株融合蛋白基因核苷酸序列分析

通过反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增出新城疫病毒国内标准强毒株Ｆ４８Ｅ９的融合蛋白基因的ｃＤ－ＮＡ。经双粘端定向克隆到ｐＵＣ１９的多克隆位点中，采用Ｓａｎｇｅｒ’ｓ双脱氧末端终止法测定ｃＤＮＡ片段的核苷酸序列，并推导出其氨基酸序列。Ｆ基因全长为１６６２个ｂｐ，单一的开放阅读框编码５５３个氨基酸的多肽。Ｆ蛋白的疏水构型有三个强疏水区；其裂解位点的氨基酸序列为１１２Ｒ－Ｒ－Ｑ－Ｒ－１１６Ｒ－１１７Ｆ；Ｆ蛋白上共有１２个Ｃｙｓ残基位点和五个潜在糖基化位点。

重组猪戊型肝炎病毒ORF2区主要抗原域的原核表达及鉴定

目的:在大肠杆菌中表达猪戊型肝炎病毒ORF2区主要结构蛋白,并对其进行血清学鉴定。方法:通过RT-PCR技术从一份猪粪中扩增并克隆戊型肝炎病毒主要的结构基因片段,将该片段插入pET-32a表达载体,在原核系统中融合表达蛋白,Western blot和间接ELISA方法分析该蛋白的抗原性。结果:SDS-PAGE分析结果表明,获得45kD的目的蛋白,该重组蛋白可以与HEV阳性血清反应,而不与阴性血清反应,表明该蛋白具有良好的抗原性。结论:本研究获得了猪戊型肝炎病毒重组抗原,可与HEV阳性血清产生特异性的结合反应,可以作为诊断用的重组蛋白,为研制敏感、特异的HEV诊断试剂盒,行之有效的HEV基因工程疫苗及为HEV感染的预防和临床治疗提供资料。

新城疫病毒F48E9株HN基因核苷酸序列

本研究采用 Ｓａｎｇｅｒ＇ｓ 双脱氧末端终止法测定了新城疫病毒国内标准强毒株 Ｆ４８ Ｅ９ 血凝素神经氨酸酶基因 ｃ Ｄ Ｎ Ａ 的核苷酸序列，推导出其氨基酸序列。 Ｆ４８ Ｅ９ Ｈ Ｎ 基因编码区全长为 １７１３ｂｐ，单一的开放阅读框编码５７１ 个氨基酸的糖蛋白。含有６ 个潜在的与天门冬酰胺（ Ｎ）连接的复合寡聚糖和高甘露糖寡聚糖结合位点，其中有 ５ 个簇集在蛋白分子的 Ｃ末端一半内，有１３ 个半胱氨酸残基。发现６ 个 Ｆ４８ Ｅ９ 特有的氨基酸残基，３７ 位 Ｆ（ Ｌ）、３８ 位 Ｓ（ Ａ）、６０ 位 Ｌ（ Ｐ）、１０５ 位 Ｓ（ Ｎ）、４４３ 位 Ａ（ Ｔ）、５７１ 位 Ｉ（ Ｖ），这些位点除了 ６０ 位的 Ｐ有两株为 Ｓ以外，其它的在 １３ 株已知序列中均为高度保守序列。