第一讲 如何选择临床科研课题

临床研究对促进医学的发展 ,提高疾病的诊断和治疗技术具有重要作用 ,也是培养临床医学工作者的重要手段。当前 ,我国开展临床研究的医院日渐增多 ,这是非常可喜的现象 ,为了广大青年临床工作者的需要 ,特刊登一组如何进行临床研究的文章 ,邀请专家撰写 ,共分五讲 :(一 )如果选择临床科研课题 ;(二 )临床研究的程序及其要点 ;(三 )临床研究的实验室工作 ;(四 )研究结果的统计学问题 ;(五 )如何写研究工作的英文论文。将在本卷逐期刊载 ,以飨读者。

重组人血小板生成素治疗实体肿瘤患者化疗后血小板减少的多中心临床试验

目的 评价国产重组人血小板生成素(rhTPO)治疗实体肿瘤患者化疗后血小板减少的临床疗效和安全性。方法 采用随机交叉自身对照研究,154例实体瘤患者随机分为A、B两组,每组77例,接受方案和剂量相同的两周期化疗。A组:第1个周期(用药周期)注射rhTPO,第二个周期(对照周期)不注射rhTPO;B组:第1个周期(对照周期)不注射rhTPO,第2个周期(用药周期)注射rhTPO。两组患者均于用药周期化疗结束后6～24 h皮下注射rhTPO 1.0μg·kg-1·d-1,连续用药最长14 d。监测血尿便常规、肝肾功能、凝血功能、胸片、心电图及血清抗rhTPO抗体。结果 A、B两组用药周期与对照周期血小板减少程度和持续时间差异无显著性。154例实体瘤患者用药周期与对照周期比较:(1)化疗后血小板下降的最低值分别为(64.4±45.4)×109/L和(52.4±30.9)×109/L(P=0.000),血小板计数恢复后的最高值分别为(263.9±142.5)×109/L和(148.9±67.7)×109/L(P=0.000);(2)化疗后血小板<50×109/L的持续时间分别为(2.5±3.9)和(3.7±5.7)d(P=0.04);(3)用药周期化疗后血小板恢复至75×109/L、100×109/L以上所需天数为(10.3±8.7)和(14.0±8.9)d,而对照周期为(15.9±10.5)和(21.1±9.5)d(P=0.000);(4)血小板平均输注量两周期比较无差异;(5)化疗后血红蛋白、白细胞?

亚硒酸钠诱导人急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4细胞氧化应激和细胞凋亡

目的 研究亚硒酸钠诱导NB4细胞的氧化应激和细胞凋亡。方法 MTT比色法检测亚硒酸钠对NB4细胞的生长抑制 ;用形态学、DNA琼脂糖电泳和流式细胞术研究亚硒酸钠诱导NB4细胞凋亡的作用 ;用化学发光法和比色法研究亚硒酸钠对NB4细胞内氧化应激的影响。结果 亚硒酸钠可以时间和剂量依赖性地抑制NB4细胞生长和诱导NB4细胞凋亡。亚硒酸钠 (≥ 5μmol·L-1 )提高了NB4细胞内ROS水平 ,同时伴有细胞内还原型谷胱甘肽含量下降 ,而抗氧化剂NAC可抑制亚硒酸钠诱导的NB4细胞氧化应激和细胞凋亡。

舞蹈病-棘红细胞增多症

目的回顾1例舞蹈病-棘红细胞增多症患者的诊断与治疗过程,以了解其临床特点。方法与结果32岁男性患者,因双上肢不自主运动加重,伴发作性意识丧失、行走不稳11年就诊。体格检查:双上肢不自主运动,右上肢舞蹈样运动,左手呈静止性震颤,行走时躯干及下肢向右侧扭转,站立时脚趾不自主运动。肌张力偏低,四肢腱反射偏低。右侧指鼻试验略欠稳准,存在意向性震颤;双手轮替试验笨拙。智商评分为78分,焦虑、抑郁量表评分均于正常值范围。实验室检查:外周血涂片Giemsa染色棘红细胞占8%。透射扫描电子显微镜显示红细胞表面棘状突起。谷氨酰氨基转移酶29U/L,天冬氨酸氨基转移酶37U/L,血肌酸磷酸激酶1787U/L,乳酸脱氢酶295U/L,α-羟丁酸脱氢酶231U/L,脂蛋白(A)504mg/L,其余各项指标均于正常范围内。MR检查显示,双侧尾状核头萎缩明显,双侧侧脑室前角明显增宽。脑电图检查颞叶呈异常电活动。肌电图显示,上下肢周围神经源性损害,右侧正中神经感觉传导速度下降20%,波幅下降80%。临床拟诊为舞蹈病-棘红细胞增多症。经氟哌丁醇、维生素B和维生素E治疗,症状明显改善。结论对于存在多种锥体外系症状的患者,应注意考虑舞蹈病-棘红细胞增多症。该病为一组神经系统综合征,共同的特点是锥体外系症状和棘红细胞增多,可通过血涂片、红?

EPO对铁调节蛋白Hepcidin表达影响的研究

本研究探讨红细胞生成素(EPO)在正常小鼠、急性炎症小鼠和慢性病性贫血(ACD)小鼠模型中对hepci-dinmRNA表达的影响。通过小鼠背部皮下双肩胛骨间脂肪垫内注射松节油的方法建立急性炎症模型和ACD模型。正常小鼠、急性炎症期小鼠和ACD小鼠腹腔注射EPO后用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)半定量法检测肝脏hepcidinmRNA的表达水平。结果显示,长期慢性炎症并未使小鼠肝脏hepcidinmRNA表达显著升高,但单次注射松节油可以使小鼠肝脏hepcidinmRNA水平一过性显著升高。腹腔注射EPO能够抑制正常小鼠、ACD小鼠与急性炎症小鼠肝脏hepcidinmRNA的表达。ACD小鼠在注射EPO后血红蛋白水平与肝脏hepcidinmRNA表达水平呈线性负相关。结论皮下多次注射松节油可以建立ACD模型。在ACD发病过程早期肝脏hepcidinmRNA升高,在此之后恢复正常。EPO在正常条件、急性炎症条件和慢性炎症条件下均可抑制hepcidinmRNA的表达。

肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β和巨噬细胞炎性蛋白1α在感染及器官损伤中的作用及治疗探讨

首先用全血内毒素血症动物模型，以内毒素刺激全血，显示动物上清液肿瘤坏死因子（ＴＮＦα）浓度随内毒素剂量增加而增加，地塞米松明显抑制其释放，布洛芬对αＴＮＦα释放为双向效应。腹腔注射内毒素复制大鼠急性肺损伤模型，显示肺毛细血管通透性随内毒素剂量增大而增加，提前１小时注射地塞米松、布洛芬能防止血管通透性增加；同时观察到肺组织中ＴＮＦα、白细胞介素１β（ＩＬ１β）、巨噬细胞炎性蛋白１α（ＭＩＰ１α）及ｍＲＮＡ含量随内毒素剂量增大而增多，峰值在２，６和１２小时，地塞米松、布洛芬对肺组织中细胞因子表达具有明显抑制。说明ＴＮＦα、ＩＬ１β、ＭＩＰ１α在内毒素诱发的肺损伤中起重要作用，地塞米松、布洛芬通过抑制细胞因子表达。

CD138/Syndecan-1在多发性骨髓瘤免疫表型中的意义

为了建立多发性骨髓瘤(MM)免疫分型的测定方法,分析各种抗原的表达特点,并分选高纯度原代骨髓瘤细胞,应用CD45/侧向角(SSC)设门的三色免疫荧光流式细胞术(FCM)测定18例MM患者、20例急性白血病(AL)患者和7例正常人骨髓免疫分型特点;应用抗CD138和免疫磁珠从MM患者的骨髓中分选骨髓瘤细胞。结果表明:骨髓瘤细胞CD45阴性或弱阳性,SSC介于有核红细胞和中性粒细胞之间,CD138和CD38均阳性,T、B细胞及髓系抗原多为阴性,CD56阳性率为83.3%,HLADR阳性率为44.4%。与MM患者相比,AL患者CD138均阴性,而CD38为100%阳性,CD56阳性率为25%。正常人CD138和CD56均为阴性。磁珠分选获得的原代骨髓瘤细胞纯度在73%-95%之间,平均为86%。结论:CD45/SSC设门的三色免疫荧光FCM是测定MM免疫分型的稳定可靠方法,CD138是骨髓瘤细胞表面较为特异的抗原标志,应用抗CD138和免疫磁珠可以获得高度富集的原代骨髓瘤细胞。

裸鼠腹腔输注体外扩增的阵发性睡眠性血红蛋白尿症病人骨髓CD34^+CD59^+细胞的研究

应用BALB/c裸鼠为移植模型,将在体外扩增的阵发性睡眠性血红蛋白尿症(paroxysmal nocturnal hemo-globinuria,PNH)病人的CD34+CD59+细胞进行移植,研究其增殖能力和重建造血的情况,为实现PNH患者进行临床自体骨髓移植(ABMT)或自体外周血干细胞移植(APBSCT)奠定基础。本研究利用免疫磁珠双阳性分选法,从PNH患者骨髓中分离出足够数量的CD34+CD59+细胞进行体外扩增,并将体外扩增的细胞输注给接受亚致死剂量照射的BALB/c裸鼠。结果显示:移植6周后,用流式细胞术和DNA检测方法均检测到裸鼠骨髓、脾脏和外周血中人的CD45+细胞,而接受PNH病人CD34+CD59+细胞移植后的裸鼠,其血常规指标有一定恢复,但并未完全恢复。结论:PNH病人骨髓CD34+CD59+细胞体外扩增后仍能保持造血祖细胞的生物特性,在照射的裸鼠中能重建造血。

磁珠双阳性分选法在阵发性睡眠性血红蛋白尿症患者骨髓CD34^+CD59^+细胞体外扩增的应用

应用磁珠双阳性分选法在体外扩增阵发性睡眠性血红蛋白尿症 (PNH)患者的CD34+ CD5 9+ 细胞 ,为实现PNH患者进行临床自体骨髓移植 (ABMT)或自体外周血干细胞移植 (APBSCT)奠定基础。流式细胞术分选虽然经常用于细胞纯化 ,但难于满足大规模临床细胞分选的需要。本研究利用免疫磁珠系统 ,应用隔夜孵育法去除第一次分选时CD34+ 细胞吸附的磁珠 ,经过两次磁珠双阳性分选 ,从PNH患者骨髓中分离出足够数量的CD34+CD5 9+ 细胞 ,用于体外培养扩增。结果显示 :磁珠双阳性法分选的CD34+ CD5 9+ 细胞与磁珠 流式细胞术二步分选法比较 ,在细胞生存、增殖、扩增及形成造血集落形成单位 (CFU )的能力上均无显著性差异。结论 :磁珠双阳性分选法可能推广应用于其它双阳性或多阳性细胞的分离纯化 ,尤其是造血干

国产重组人血小板生成素单次皮下注射的药代动力学研究

目的：研究国产重组人血小板生成素单次皮下注射在人体内的药代动力学特征。方法：２４名健康志愿者随机分为 ０．５ ｍｇ·ｋｇ^（－１），１．０ ｍｇ·ｋｇ^（－１）和 ２．０ ｍｇ·ｋｇ^（－１） ３个剂量组，单次皮下注射相应剂量的重组人血小板生成素。于给药前和给药后不同时间取血，分离血清，采用ＥＬＩＳＡ测定血药浓度。结果：正常人皮下注射重组人血小板生成素 ０．５，１．０和 ２．０ μｇ·ｋｇ^（－１）后，ｔｐｅａｋ分别为 ９．０±１．９ｈ，１０．８±２．４ｈ和１１．８±５．１ｈ，Ｃｍａｘ分别为０．２９８±０．０８１ｍｇ·Ｌ^（－１），０．４３８±０．０７６ ｍｇ·Ｌ^（－１）和０．８３１±０．０７９ μｇ·Ｌ^（－１），ＡＵＣ与给药剂量基本成正比。人体内重组人血小板生成素的消除较缓慢，３个组的ｔ_（１／２ｋｅ）分别为４６．３±６．９ ｈ，４０．２±９．４ｈ和３８．７±１１．９ｈ。结论：当以０．５－２．０μｇ·ｋｇ^（－１）皮下注射时，重组人血小板生成素在正常人体内表现为线性药代动力学特征，但消除半衰期较长。

血小板减少患者多次皮下注射重组人血小板生成素的药代动力学研究

目的研究国产重组人血小板生成素(rhTPO)多次皮下注射在人体内的药代动力学。方法8例血小板减少患者分为隔日给药组,隔日皮下注射rhTPO 1.0 mg.kg-1,共7次;每日给药组,每日皮下注射rhTPO 1.0 mg.kg-1,共14次,每组4例。在给药前及给药后不同时间取血,分离血清。用酶联免疫吸附实验法测定血清rhTPO浓度。结果随给药次数的增加,血药浓度随之升高,隔日给药组和每日给药组的谷浓度(Cmin)分别在5,7次给药后达到稳态水平,稳态Cmin分别为1.64 ±0.97和2.91 ± 1.74mg.L-1。2组Cmax的变化趋势与Cmin相似,稳态峰Cmax分别为2.14 ± 1.10和 4.19±3.44mg.L-1。首次给药与末次给药后的药代动力学参数无明显差异。结论 血小板减少患者多次皮下注射rhTPO后,血药浓度升高的水平与累积给药量呈正相关;在给药14次后,药物在体内无蓄积倾向。

多剂量皮下注射重组人促红细胞生成素在健康人体的药代动力学

目的观察不同剂量国产重组人促红细胞生成素(rhEPO)皮下注射在健康人体的药代动力学.方法12名健康志愿者随机分为2个剂量组(50和150 IU·kg-1),每组6例.分别皮下注射rhEPO,共7次.用酶联免疫吸附实验法测定血清rhEPO浓度.结果给药前12名健康志愿者血清EPO基础水平波动于3.75～13.75 mU·ml-1.2组谷浓度(Cmin)在给药4～6次后,达稳态水平.高剂量组首次和末次给药后的AUC(0-96h)分别是低剂量组的2.8倍和3.0倍,Cmax分别是3.1倍和3.6倍.第1次给药后,每个受试者的tmax和t1/2等药代动力学参数与末次给药后比较无明显差异.结论剂量在50～150 IU·kg-1,多次皮下注射rhEPO,血药浓度水平与给药剂量呈正相关;药物吸收和清除基本上无时间依赖性;在给药7次内,未观察到体内蓄积倾向.

遗传性蛋白S缺乏症一家系的表型分析

为了解一遗传性蛋白S(PS)缺乏症家系的临床表型 ,对其家系成员进行调查。采用了凝固法测定PS活性、ELISA法检测总蛋白S(TPS)和游离蛋白S(FPS)抗原。结果为该家系 3代 10名成员PS活性在 11 3%～ 5 3 3% (参考值 5 5 %～ 14 5 % ) ,FPS在 2 4 6 %～ 35 2 % (参考值 5 6 %～ 15 0 % ) ,较正常参考值明显降低 ,其中 8人的TPS在 4 4 %- 30 5 % (参考值 5 8% - 15 0 % ) ,而另外 2人的TPS在正常范围内 ,分别为 6 2 7%和 70 8%。以上结果显示

阵发性睡眠性血红蛋白尿症患者骨髓CD34^+CD59^+细胞与正常人CD34^+细胞生存、增殖、扩增性能的比较

目的探索阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)患者骨髓CD34CD59细胞体外扩增的方法,并对其与正常人CD34+细胞的生存、增殖及扩增性能进行比较,为PNH患者实现自体骨髓移植(ABMT)或自体外周血干细胞移植(APBSCT)提供重要的实验基础。方法应用免疫磁珠富集纯化CD34+细胞,然后用流式细胞仪分选出PNH患者的CD34+CD59+细胞及正常人CD34+细胞。对两种细胞在不同造血生长因子组合下,进行体外扩增液体培养2周。并对扩增前及扩增不同阶段的细胞进行体外半固体培养。结果(1)PNH患者CD34+CD59+细胞在体外能得到有效的扩增,在细胞因子合理组合作用下,第7天时CD34+CD59+细胞绝对数扩增约23.49倍。2PNH患者CD34+CD59+细胞与正常人CD34+细胞存在部分相同或相似的特性。在体外扩增过程中,对细胞因子的反应有相同的趋势,均为扩增第7天达到扩增高峰,均在SCF+IL-3+IL-6+FL+Tpo+Epo组合条件下达到最大扩增能力。并且扩增后的细胞仍有形成CFU的能力,均能很好地保持CD59抗原,无GPI锚连蛋白的丢失。(3)正常人CD34+细胞在生存、增殖、形成CFU的能力及扩增能力上均明显强于PNH患者的CD34+CD59+细胞。结论(1)PNH患者CD34+CD59+细胞在体外能得到有效的扩增,临床上应用具有一定的可行性,能满足大多数PNH患者ABMT或APBSCT的需要。(2)

自体外周血造血干细胞移植后淋巴细胞亚群的恢复

目的探讨自体外周血造血干细胞移植(auto-PBSCT)后免疫重建的规律。方法测定血液肿瘤患者auto-PBSCT前后淋巴细胞各亚群的绝对值。结果部分亚群在移植前低于正常。移植后各细胞亚群恢复时间不同,其中NK细胞在6个月恢复;B细胞在9个月恢复正常。T细胞总数在9个月恢复正常,其中主要为CD3+CD8+细胞。CD3+CD4+细胞在18个月恢复,而CD4+CD28+细胞在2年内仍未恢复。CD3+CD8+细胞在移植后早期有所下降,在3个月时恢复并高于正常,至9个月时逐渐下降至正常。CD3+CD8+细胞的主要部分是免疫表型呈活化的T细胞,即CD8+HLA-DR+细胞和CD8+CD38+细胞。两者分别在1个月和3个月时高于正常,在9个月时恢复正常。结论血液肿瘤患者移植前即存在淋巴细胞亚群异常的前提下,移植后NK细胞最先恢复,其次为B细胞,T细胞各亚群中CD3+CD8+细胞恢复较早,其中主要为活化T细胞。

多发性骨髓瘤早期死亡的临床危险因素分析

目的探讨多发性骨髓瘤患者早期死亡的临床危险因素。方法回顾性分析18例早期死亡(6个月内)的初治多发性骨髓瘤患者的临床资料。单因素和LOGISTIC回归多因素分析影响多发性骨髓瘤患者早期死亡的临床危险因素。结果单因素分析发现,年龄、血乳酸脱氢酶(LDH)水平、血白蛋白水平、血肌酐(CR)水平、血Β2微球蛋白(Β2"MG)水平和是否合并有淀粉样变是早期死亡的危险因素;而多因素分析确定只有血白蛋白水平、血CR水平、血Β2"MG水平及是否合并有淀粉样变是早期死亡的危险因素。结论低白蛋白血症、肾功能不全、高血Β2"MG水平、合并有淀粉样变的多发性骨髓瘤患者是早期死亡的高危患者。

严重自身免疫性疾病患者的外周血CD34^+细胞动员

目的探讨严重自身免疫性疾病患者外周血CD34+细胞动员的规律和安全性。方法以CTX+rhG-CSF方案对严重自身免疫性疾病患者进行外周血CD34+细胞动员。结果动员后可获得单个核细胞(MNC)4.52(1.15~14.05)×108/kg,其中CD34+细胞为5.18(1.30~26.35)×106/kg。19例次患者注射CTX后ANC<0.5×109L-1,获得MNC 4.33(1.15~9.5)×108/kg、CD34+细胞5.16(1.30~26.35)×106/kg;23例次患者注射CTX后ANC≥0.5×109L-1,获得MNC 4.45(1.21~14.05)×108/kg、CD34+细胞5.41(1.0~24.10)×106/Kg。2组间无差异。动员过程中原发病无明显恶化,所有患者原发病均得到不同程度的缓解。其中SLE患者SLE-DAI评分由17(12~24)分降至3(0~4)分(P<0.01),RA患者均达到ACR20标准。1例患者出现急性肾功能衰竭,1例患者死于TTP,3例患者动员失败。结论以CTX+rhG-CSF方案可有效地动员出足够的CD34+细胞,并能缓解原发病。动员过程中不良反应可耐受,但仍发生严重并发症甚至死亡。在少数动员失败的患者中,原因尚需进一步探讨。