心血管疾病蛋白质组学研究进展

随着蛋白质组学技术的迅速发展及其在心血管疾病的应用,我们从蛋白质水平对心血管疾病病理改变有了进一步的认识.文中以目前蛋白质组学技术在心血管疾病领域的研究进展,总结蛋白质组学技术在相关心血管疾病的病理改变以及诊断方面的应用进展.蛋白质组学技术发展迅速,将来可能常规应用于基础和临床.

双基因共表达在血管再狭窄研究中的应用

目的 观察携带反义凝血酶受体 (ATR)和p2 1的双基因载体共表达后对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用 ,为再狭窄基因治疗寻求新途径。 方法 以携带ATR或 和p2 1的单、双基因载体重组腺病毒伴随病毒(rAAV)感染培养的人主动脉平滑肌细胞 (hASMC) ,用半定量RT PCR检测各基因的整合与表达 ,MTT法测定病毒感染后不同时间点的细胞存活率。将携带AP双基因的rAAV导入WKY大鼠拉伤侧的颈总动脉 ,免疫组织化学法分别检测凝血酶受体 (TR)和p2 1两基因在动脉壁中的表达。 结果 RT PCR结果显示 ,TR单基因的mRNA表达降低 ,p2 1单基因表达升高 ,AP双基因得到了共表达 ;MTT法测定的生长曲线显示 ,双基因对hASMC增殖的抑制作用大于两个单基因 ;免疫组织化学证实 ,AP双基因导入后 ,TR基因的表达受到完全抑制 ,p2 1基因的表达明显增加 ,血管新生内膜与平滑肌细胞的增殖受到了抑制。 结论 ATR和p2 1双基因共表达在体外可明显抑制ASMC的增殖 ,在体内可明显抑制血管内膜新生和中膜的增生。

哺乳动物心肌细胞不同功能性电压门控的钾通道多样性分子基础

哺乳动物心脏中,不依赖于钙离子的、去极化激活的钾离子电流对于动作电位的波形形成起着重要作用,几种完成这种功能的电压门控的钾电流已经被鉴定出来.在大多数心肌细胞中,瞬时外向电流,Ito.f与Ito.s,以及几类延迟再激活的电流成分,包括Ikr,Iks,Ikur与IK,slow都有表达.尽管如此,这些电流仍然存在着种属间以及细胞类型与区域间的表达形式的差异,这种差异能以动作电位的波形变化加以体现.大量的电压门控的钾通道核心(α)与附属亚基(β,minK,MiRP)已经被克隆出来并且已被证明在心脏中有表达,一系列的实验方法已经被提出以用来通过体内或者体外方法来研究这些亚基与功能性电压门控钾通道的关系.最近这些关系的研究已经取得了相当大的进展,现在清楚的是在心肌细胞中不同的分子构成是不同的电生理复极化钾电流的基础.

人细胞骨架调节蛋白基因Nelin的原核表达与分离纯化

目的:原核表达并分离纯化人细胞骨架调节蛋白基因Nelin。方法:利用DNAstar软件预测Nelin的B细胞表位,选择Nelin基因B细胞表位较多、特异性最强的片段。用DNA重组技术,将此片段插入原核表达载体pET28a(+),构建C末端带有His6标签的原核表达载体pET28a-Nelin,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导,产物用Ni2+金属螯合吸附层析柱纯化。结果:成功构建了pET28a-Nelin表达载体,IPTG诱导后表达分子量约为17000的可溶性蛋白,Nelin-His6蛋白的表达量占菌体总蛋白的18%,经Ni2+金属螯合层析柱纯化,得到了电泳纯的Nelin-His6蛋白。结论:建立了稳定的Nelin基因的表达体系,为其功能研究奠定了基础。

病毒性心肌炎细胞感染模型的建立及实验研究

目的:建立病毒性心肌炎细胞感染模型。方法:以柯萨奇B_3病毒感染原代培养的乳鼠心肌细胞,镜下观察心肌细胞搏动次数、细胞病变、测定DNA含量及MTY活细胞染色。结果:采用差速贴壁法获得的活心肌细胞数>90％(台盼蓝染色),心肌细胞多核、多形性特征明显(HE染色);感染CVB_324小时后,心肌搏动频率紊乱,感染48小时至一周后心肌搏动次数明显减少(P<0.01),随后肌丝断裂,细胞圆缩、脱落,细胞病变程度与MTF染色OD值呈明显负相关。细胞周期分析显示细胞受阻于G_1期,有凋亡峰出现。结论:乳鼠心肌细胞原代培养及CVB_3感染方法的建立,可作为研究病毒性心肌炎药物筛选和治疗的重要体外模型。

反义TR和p21双基因共表达对人主动脉平滑肌细胞增殖与凋亡的作用

目的观察携带反义凝血酶受体(ATR)或/和p21的单、双基因重组腺病毒伴随病毒(rAAV)载体对人主动脉平滑肌细胞(ASMC)增殖与凋亡的影响。方法以携带ATR或/和p21的单、双基因rAAV感染人ASMC。半定量RT-PCR检测各基因的整合与表达;MTT法测定感染不同时间点的细胞存活率;流式细胞术检测细胞周期与凋亡细胞数目的变化;吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)染色检测凋亡细胞的比率。结果单、双基因在ASMC中均获得整合,且双基因发生了共表达;病毒感染4d时,ATR组、p21组和AP双基因组的细胞存活率与对照组相比分别降低了16.7%、21.6%和29.4%;三组的G0/G1期细胞数分别为(61.8±2.9)%、(82.5±4.0)%和(80.4±6.1)%;凋亡细胞数为(4.8±0.5)%、(5.7±0.1)%和(9.2±0.9)%;AO/EB染色显示的凋亡细胞比率分别为:对照组(1.5±0.8)%、ATR组(7.2±3.3)%、p21组(10.7±5.6)%、AP组(18.3±2.7)%。结论(1)双基因共表达对抑制细胞增殖和诱导凋亡的作用均较单基因具有较强的生物学效应。(2)为再狭窄的基因治疗提示了更优化的途径。

黄芪总提取物对心肌细胞的保护作用及对c-myc基因表达的影响

目的 观察黄芪总提取物在病毒性心肌炎体外细胞培养模型中的药效作用,以及对细胞凋亡调控基因c-myc表达的影响。方法 柯萨奇病毒感染乳鼠原代心肌细胞后于不同时间加入黄芪总提取物和/或病毒,逐日观察心肌细胞搏动次数、细胞病变,MTT染色比较各组间活细胞数的变化,病毒繁殖抑制实验比较TCID50的差别以验证黄芪总提取物的抗病毒活性。实验以盐酸胍作为阳性对照药。应用流式细胞计量术、DNA Ladder分析凋亡发生情况,RT-PCR测定c-myc表达变化。结果 TEA在体外实验中能有效抑制CVB3引起的细胞病变(P<0.01),加药组比病毒对照组TCID50降低两个以上对数值,其药效优于同等浓度的抗病毒对照药物。流式细胞仪检测显示加药组凋亡细胞数目明显减少,RTPCR结果提示黄芪总提取物能下调凋亡早期基因c-myc的表达。结论 黄芪总提取物对体外培养的心肌细胞具有保护作用,其机理可能与下调凋亡调控基因c-myc表达有关。

Nelin与F-actin及Filamin相互作用的鉴定

目的在用酵母双杂交方法将Nelin与人心脏cDNA文库进行杂交筛选,得到3个阳性克隆的基础上,进一步探讨新基因Nelin及其心肌表达产物Nelin蛋白的功能,并寻找能够与其发生相互作用的蛋白质。方法采用基因转染和表达技术,在真核细胞内外分别进行了Nelin蛋白与肌动蛋白(F-actin)结合的共沉降及免疫荧光共定位实验。并通过免疫共沉淀实验进一步验证所得的实验结果。结果证实了在细胞内外Nelin蛋白均能同F-actin相结合;还能与Filamin的C-末端免疫球蛋白样结构发生相互作用。结论Nelin为一个新的兼有actin及Filamin结合能力的蛋白。在心肌细胞内,Nelin很可能作为一个膜-细胞骨架连接蛋白,参与了细胞黏着斑形成的过程。

9-顺维甲酸诱导的肺癌细胞RXR_S受体转录水平的变化

目的 :检测用 9 cis RA处理前后肺腺癌细胞株PG和A54 9维甲酸受体RXRS 不同时相的表达变化。方法 :将两细胞株分别分为 9 cis RA组和对照组 ,应用细胞计数方法统计每组各时相细胞数 ,相对定量RT PCR方法检测组加药前后RXRS 各亚型在不同时相的表达变化。结果 :加入 9 cis RA后 ,PG和A54 9细胞RXRSmRNA转录水平检测结果显示 :(1)RXRγ 在两细胞株中均有一定水平的基础转录 ,而RXRα、RXRβ 均无基础转录。 (2 )应用 1uM 9 cis RA后 ,两细胞株的RXRγ 有短暂增高 ,其余受体转录无明显变化。结论 :RXRγ 可能参与介导 9 cis

对血浆Lp(a)致动脉硬化作用的再评价—9540正常人群及4055病例对照结果分析

目的观察中国正常人群血浆Lp(a)的分布情况及特点,分析血浆Lp(a)水平的变化与心脑血管疾病危险性的关系,进一步证实血浆Lp(a)致动脉硬化的作用。方法采用ELISA的方法检测了9540正常人群的血浆Lp(a),分析了年龄、性别与L(a)水平之间的关系。检测了530例心肌梗死患者(冠脉造影证实)及229例对照(冠脉造影阴性)和1386例脑梗死患者(头颅CT或核磁共振检查证实)及1910例对照的血浆Lp(a),分析了血浆Lp(a)变化与疾病危险性的关系。结果(1)正常人群血浆Lp(a)呈偏态分布(P<0.01),中位数为19.6mg/dl,全距为209.7mg/dl。不同年龄、性别血浆Lp(a)水平分布情况,除大于50岁的女性以外,其余各组之间比较均无显著性差异。正常人的Lp(a)水平主要分布在11-20mg/dl的范围;(2)疾病组血浆Lp(a)水平明显高于对照组(P<0.001),Lp(a)>30mg/dl者,心肌梗死组占43.4%,脑梗死组占68.5%,与对照组比较有显著性差异(P<0.001),且随着Lp(a)浓度升高,心脑血管疾病的危险性有上升的趋势;(3)Logistic回归分析结果显示:Lp(a)>30%者发生心肌梗死的危险性增加(OR值为2.2,95%,CI:1.498-3.167,P<0.001)和脑梗死的危险性增加(OR值为2.1,95%,CI:1.767-2.489,P<0.001)。结论Lp(a)与动脉硬化密切相关,随着浓度升高,心脑血管疾病的危险性增加,它是一个独立的危险因子。

转录因子GATA-4在心肌分化、肥厚及凋亡中的作用

锌指结构家族成员GATA-4作为一种特定的细胞核转录因子,涉及基因调节的不同环节,控制着基因的表达和功能的调节,正日益受到高度重视。该文系统阐述了GATA-4因子的结构、表达及其在心脏发育、心肌肥厚和抗心肌细胞凋亡方面的作用。

心肌特异表达基因p93的激酶及丝氨酸结构域在大肠杆菌中的高效表达

目的 在大肠杆菌中高水平表达并分离纯化心脏特异表达基因p93的激酶与丝氨酸结构域片段。方法 利用DNA重组技术 ,构建C末端带有 6×His标签的p93激酶与丝氨酸结构域(p93 C)片段的原核表达载体pET2 8a p93 C。对诱导表达条件和包涵体洗涤条件优化后 ,用Ni2 +金属螯合吸附层析柱纯化。结果 成功构建了pET2 8a p93 C原核表达载体 ,诱导后摇床转速在 35 0r/min下表达量最高 ,包涵体洗涤在超声条件下较好 ,分离纯化后从 10 0ml菌液中可获得 2 5mg蛋白。结论建立了高效稳定的p93 C原核表达体系以及较好的包涵体洗涤方法。

血浆中高级糖化终产物的水平与糖尿病并发症的关系研究

目的 探讨高级糖化终产物与糖尿病并发症的关系。方法 采用本实验室自行研制的竞争性酶联免疫吸附分析方法,测定了糖尿病有并发症组病人血浆95例,糖尿病无并发症组人血浆65例,正常对照65例。结果:在糖尿病有并发症组中,高级糖化终产物(AGEs)浓度[(6.625(1.691)U/mL,n=95]明显高于糖尿病无并发症组[(5.904(2.071)U/mL,n=65,p=0.017],也明显高于正常人组[(5.337(1.138,n=65,p<0.005]。以有无并发症为应变量进行多元logistic回归分析显示,血浆AGEs浓度>6.085U/ml者,糖尿病并发症发生的危险性增加(OR值为2.989,95％可信限为1.407-6.350)。多元逐步线性回归显示:糖尿病病程、冠心病史与血浆AGEs浓度之间有线性关系。结论 血浆AGEs浓度是糖尿病发生并发症的独立危险因素。

人细胞骨架调节蛋白基因Nelin N端片段的原核表达

[目的 ]构建Nelin基因N端片段的原核表达载体并表达此蛋白 .[方法 ]设计带有BamHI/EcoRI酶切位点的引物 ,以已构建好的质粒pGEX 5X Nelin为模板 ,用PCR扩增Nelin基因N端片段 ,并用BamHI/EcoRI酶切PCR产物和原核表达载体 pGEX 5X 1,然后用T4DNA连接酶将其连接 ,得到重组表达质粒 pGEX 5X Nelin 1,经双酶切鉴定和测序验证 .重组表达质粒转化大肠杆菌BL 2 1,用异丙基硫代 β D 半乳糖苷 (IPTG)诱导 ,以SDS PAGE进行分析 .[结果 ]成功构建并表达了分子量约为 43KD的NelinN端片段的融合蛋白 .[结论 ]所表达的蛋白为蛋白纯化。

核纤层蛋白Lamins的结构、功能及相关疾病的研究

核纤层蛋白(Lamins)属中等纤维蛋白家族(IF),其多聚体组成网格状结构紧贴于内层核膜内表面,在维持核的正常形态以及在核周期性的解体和重组装过程中发挥重要作用。蛋白内部不同位点的缺失和突变目前已知可引起四种不同的临床综合征。

E82K新突变对Lamin A与Emerin蛋白结合能力的影响

目的 :研究LaminAE82K突变型蛋白与Emerin蛋白结合能力的减弱是否会导致家族性扩张型心肌病。方法 :构建Emerin基因野生型和LaminA基因野生型和E82K突变型表达载体 ,将Emerin基因表达载体分别与LaminA基因野生型及突变型表达载体共转染HEK2 93细胞 ,免疫共沉淀的方法检测野生型和突变型LaminA蛋白与Emerin蛋白的结合力的差异。结果 :LaminA野生型和E82K突变型蛋白与Emerin蛋白的结合能力不存在明显差异。结论

心肌特异性新蛋白激酶p93和peroxiredoxin3的相互作用

为了明确p93在心血管系统中的生物学功能及在信号传导通路中的作用 ,采用酵母双杂交技术 ,选择 p93N端第 10 1～ 372位氨基酸构建诱饵质粒 ,筛选成人心脏cDNA文库 ,寻找与之相互作用的蛋白质 ,结果得到蛋白peroxiredoxin 3(PRX 3) .采用体外结合实验和免疫共沉淀等方法 ,证实了原核和真核表达的 p93确实可与PRX3相互作用 ,通过双重荧光共定位 ,为二者的相互作用提供了定位依据 .研究提示p93可能参与心肌细胞中与PRX3有关的各种生理病理过程 ,如生长、分化、发育、凋亡。

高血压大鼠心脏钙调蛋白磷酸酶与核因子κBp65的表达

目的探讨钙调蛋白磷酸酶(caicineurin)、核因子κBp65(NFκBp65)在高血压心血管重构信号转导通路的作用。方法建立腹主动脉缩窄高血压大鼠模型,以尾动脉测压法观察大鼠血压变化,用免疫组织化学和形态计量学方法,观察calcineurin、NFκBp65在心脏原位蛋白表达和心脏重量及其系数的变化。结果与假手术组比较,高血压大鼠血压明显升高[(144.70±4.85)vs(110.00±4.00)mmHg,P<0.01;(151.40±14.86)vs(114.36±5.5)mmHg,P<0.01]、心脏重量及其系数显著增加[(1.87±0.07)vs(1.51±0.13)g,P<0.01,(0.43±0.02)vs(0.33±0.01)g/100g,P<0.01]、心脏重构,钙调蛋白磷酸酶与NFκBp65在心脏过表达,而且阳性表达面积和阳性表达面积百分比增大[(107380.36±9268.64)vs.(14537.64±12169.42)μm2,P<0.01;(54797.00±17483.46)vs(3501.43±2919.18)μm2,P<0.01]。结论calcineurin与NFκBp65过表达参与了腹主动脉缩窄性高血压心血管重构的发生。

Angiopoietin Ⅰ基因多态性在出血性脑卒中的病例与对照研究

目的 研究中国人群中促血管形成素-1(Angiopoietin,ANGPT-1)基因2914C/G多态性与出血性脑卒中的关系。方法 从武汉、西安两个地区选取出血性脑卒中病例及对照358例,其中对照184例,病例174例。所有研究对象记录其病史,体检等临床资料及吸烟、饮酒等流行病学资料,采用PCRRFLP检测各组ANGPT-1 2914C/G多态性并统计各组的多态性频率。结果 C等位基因在脑卒中组和对照组分别为73％和76％,G等位基因频率在脑卒中组和对照组分别为27％和24％。基因型频率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律。出血性脑卒中组和对照组的ANGPT-1 2914C/G基因型频率及等位基因频率无显著差别。结论 ANGPT-1 2914C/G多态性与出血性脑卒中的发生无显著相关性。