BD FACSAriaIII流式细胞仪在血液学中的使用分析研究

目的:对BD FACSAriaIII流式细胞仪在应用中出现的故障原因进行分析、研究,为在科研工作中正确使用该仪器提供依据。方法:通过对2012-2013年实验血液学国家重点实验室技术平台BD FACSAriaIII流式细胞仪的使用情况进行统计,对使用过程中出现的常见故障和需要由厂商工程师现场解决的故障进行统计,总结出高发故障的原因及解决方法。结果:通过对BD FACSAriaIII流式细胞仪的故障进行分析,为高通量流式细胞分选仪的正确使用提供指导,提高仪器运行的稳定性。结论:正确的使用和良好的维护有助于保证BD FACSAriaIII流式细胞仪的正常运行,从而确保科研工作的顺利进行。

急性髓系白血病Kindlins和血管生成素表达研究

本研究旨在探讨不同白血病细胞系、成人急性髓系白血病Ang-1、Ang-2、Tie-2、Kindlin-2、Kindlin-3的表达情况及其意义。采用RQ-PCR方法检测88例AML患者、9例非肿瘤患者(对照组)以及K562、KG-1a、U937、HL-60、Jurkat细胞株中Ang-1、Ang-2、Tie-2、Kindlin-2、Kindlin-3表达水平,分析阳性率及表达水平在AML患者与对照组间的差异,探讨上述5种基因之间及其与AML分型、预后的关系。结果表明,Ang-1,Ang-2,Kindlin-3在K562、KG-1a、HL-60、U937、Jurkat细胞系中均有表达,Tie-2仅表达于KG-1a、HL-60细胞系中,Kindlin-2表达于K562、KG-1a、HL-60中。5种基因均表达于AML患者及对照组中。Ang-1、Ang-2在起病时白细胞计数较高组的表达水平较高(P<0.001,P=0.001),在伴有t(8;21)和t(15;17)的AML患者中表达均较低(P<0.001,P=0.005)。Ang-1在NCCN预后良好组表达较低(P=0.020);Ang-1低表达组完全缓解率(CR)较高(P=0.027)。Kindlin-2在AML患者中表达水平较低(P=0.010),起病时白细胞计数较高组的表达水平较低(P=0.020),伴有t(8;21)和t(15;17)AML的表达均较高(P=0.016),治疗缓解后Kindlin-2及Kindlin-3表达明显升高(P<0.001,P=0.004)。结论:Ang-1与AML不良预后因素相关;Kindlin-2在AML中低表达,与AML良好预后因素相关,可能是一个预后较好的标志。

白血病染色体MLL基因断裂(易位)FISH探针的研究

目的自主研制可以检测白血病染色体MLL基因断裂的双色FISH检测试剂盒。方法根据染色体基因图谱,选定合适的BAC克隆重叠群分别作为MLL基因断裂点5'端探针和3'端探针。采用缺口平移法,制作出5'端标记绿色荧光素,3'端标记红色荧光素的探针。用双盲法检测白血病临床样本40例,对自制探针和同类进口探针在各项技术参数上进行对比研究。结果自制探针检测MLL基因断裂(易位)的阴、阳性率与同类进口产品完全相符;在Spectrum Green和Cy3?v1通道中,自制探针的平均荧光信号强度比进口探针明显提高(自制探针分别为:2930.5±38.00,2766±59.54;进口探针分别为:2239±45.13,1986±59.56;P<0.01),自制探针信噪比分别为进口探针的2.4倍和1.9倍。结论自制的MLL基因FISH检测探针设计合理、质量可靠,与进口探针相比,荧光信号更强,信噪比更高,将来可能替代价格昂贵的进口产品。

人胎盘底蜕膜间充质干细胞的分离及其生物学特性研究

胎盘来源间充质干细胞(mesenchymal stem cells,,MSC)与骨髓间充质干细胞相比,具有来源充足、免疫原性低、病毒污染率较低,且无社会伦理争议等方面的优点,使其具有更好的临床应用前景。胎盘组织不但包括来自母体的绒毛膜组织、羊膜组织,还包括来自母体的底蜕膜组织,但底蜕膜来源间充质干细胞生物学特性还需要进一步研究探讨。我们使用酶消化法分离底蜕膜来源间充质干细胞,通过短串联重复序列分析(STR)检测细胞是否均来源于母体组织,用MTT法检测细胞生长方式,流式细胞仪分析细胞周期和细胞表型,使用不同的诱导分化培养基检测其多向分化的能力。然后将底蜕膜间充质干细胞细胞与植物血凝素刺激的外周血单个核细胞共培养,用酶联免疫吸附试验检测上清γ-干扰素的水平。结果表明:短串联重复序列分析证明所得到的细胞均来源于母体组织,底蜕膜细胞生长呈典型的成纤维细胞形态。细胞表达常见的间充质干细胞表面标记CD90、CD73、CD105、CD44,不表达CD45,CD11b和CD34。在不同的条件培养基培养状态下,细胞均可向成骨、成脂和成软骨方向分化。结论:从胎盘底蜕膜获得的细胞,具有间充质干细胞的基本特征,是底蜕膜间充质干细胞。底蜕膜间充质干细胞能抑制植物血凝素刺激的人外周血单个核细胞分泌γ-干扰素,这使得底蜕膜间充质干细胞作为一个母亲自体间充质干细胞的重要来源,能安全的用于治疗母亲的免疫系统疾病。

IL-3-LDM融合蛋白对CD123^＋白血病细胞的靶向杀伤作用

目的:构建以IL-3为靶向、力达霉素(lidamycin,LDM)为弹头的融合蛋白IL-3-LDM,观察其对多种CD123+白血病细胞的靶向杀伤作用。方法:原核表达IL-3-LDP(interleukin 3-lidamycin)融合蛋白,组装活性烯二炔(active enediyne,AE)发色团得到IL-3-LDM。流式细胞术检测不同白血病细胞系(KG1-a、TF-1、M07e、HL-60、K562、Raji)表面CD123分子的表达,并检测融合蛋白IL-3-LDM与各白血病细胞的结合能力;CCK-8检测IL-3-LDM融合蛋白对不同CD123阳性率的白血病细胞的杀伤能力。结果:组装活性发色团得到的IL-3-LDM蛋白纯度可达90%以上。急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)KG-1a细胞表面CD123阳性率最高(88.9%),其次为MO7e和TF-1细胞(>75%),再次为HL-60细胞(7.8%),而K562、Raji细胞CD123表达呈阴性。体外IL-3-LDM融合蛋白对CD123+白血病细胞(KG-1a、MO7e、TF-1和HL-60细胞)的结合能力和杀伤效率与细胞表面CD123的阳性率成正比,对于CD123表达率最高的KG-1a细胞,LDM的杀伤强度是多柔比星(adriamycin,ADR)的1 415.8倍,而IL-3-LDM的杀伤强度又是LDM的9.6倍。结论:IL-3-LDM融合蛋白可以有效携带细胞毒药物LDM并高效靶向杀伤CD123+白血病细胞。

显微成像分析技术在中性粒细胞运动及吞噬功能研究中的应用

目的:使用转盘式激光共聚焦显微镜及显微图像处理软件对中性粒细胞的运动及吞噬功能进行分析与评估。方法:使用Percoll分离液分离小鼠骨髓中性粒细胞,用PE荧光标记后与FITC标记的酵母聚糖颗粒(Zymosan)混匀,置于转盘式激光共聚焦显微镜下进行多通道时间序列成像。使用Volocity和Image J分析中性粒细胞的运动及吞噬相关参数,包括形态变化、运动轨迹、伪足振荡、结合吞噬指数,得出时间序列下各项参数的变化趋势。结果:中性粒细胞在受到Zymosan诱导后趋化作用明显,大部分细胞在短时间内发生极性化,在40分钟内能快速结合Zymosan,行使吞噬功能。结论:使用显微成像技术结合图像处理分析技术可准确、定量地分析中性粒细胞运动及吞噬功能,直观快速地对中性粒细胞的生理学状态进行初步评估。通过这项技术,得到正常生理状态下中性粒细胞对Zymosan的快速响应情况,为今后中性粒细胞相关功能学研究提供了参考依据。

钙调素拮抗剂O-(4-乙氧基)-丁基-小檗胺增强阿霉素杀伤MCF-7/ADR细胞的机制研究

目的研究钙调素拮抗剂0-4-乙氧基-丁基-小檗胺(EBB)增强阿霉素诱导乳腺癌多药耐药细胞系MCF-7/ADR细胞的杀伤作用及其相关机制。方法用MTT法测定阿霉素、EBB单独及联合用药对阿霉素杀伤乳腺癌多药耐药细胞系(MCF-7/ADR)及其亲代细胞系(MCF-7)的作用的IC50值,用不同浓度EBB处理MCF-7/ADR细胞后用FACS法分析EBB对阿霉素诱导细胞凋亡及对mdr1mRNA和P-gp蛋白水平表达的影响,通过激光共聚焦显微镜观察EBB处理前后及用EBB预处理24和48h后MCF-7/ADR和MCF-7细胞内阿霉素浓度的改变。结果MTT结果显示EBB对MCF-7和MCF-7/ADR都具有抗肿瘤活性;EBB还能协同提高阿霉素的细胞毒作用,MCF-7组两药相互作用指数(CDI)值为0.73,MCF-7/ADR组CDI值为0.49,其对耐药细胞的协同作用更为明显。随EBB剂量增加,低剂量阿霉素诱导MCF-7/ADR细胞凋亡增加而且P-gp蛋白表达水平逐渐下降,细胞内阿霉素浓度逐渐提高,而且用EBB预处理MCF-7/ADR细胞24和48h后细胞内阿霉素和罗丹明浓度也逐渐提高。结论EBB是有效的肿瘤细胞化疗药物,它不但能直接抑制P-gp功能还具有下调P-gp蛋白表达的作用,从而有效逆转MCF-7/ADR细胞的耐药现象,协同增强化疗药物对耐药细胞的杀伤作用。

比较人脐带和胎盘间充质干细胞对小鼠急性移植物抗宿主病的预防作用

背景:目前脐带、胎盘间充质干细胞在一些急性移植物抗宿主病(graft versus host disease,GVHD)临床实验及动物模型中展现了良好的预防效果,但两种干细胞哪一个对GVHD的治疗更为有效尚无文献报道。目的:观察比较人脐带和胎盘间充质干细胞的免疫调节功能,以及对小鼠急性GVHD的预防作用。方法:(1)体外实验:取人外周血单个核细胞,分4组培养,单独培养组、植物凝集素组、植物凝集素联合脐带间充质干细胞组、植物凝集素联合胎盘间充质干细胞组。5 d后,检测外周血单个核细胞增殖及培养上清干扰素γ分泌水平;(2)动物体内实验:取BABL/c(H-2d)小鼠57只,8.5 Gy全身照射后分6组,单纯照射组尾静脉注射生理盐水0.5 mL;同基因脊髓移植组尾静脉注射同种异体骨髓有核细胞悬液0.5 mL;异基因骨髓移植组尾静脉注射异种骨髓有核细胞悬液0.5 mL;急性GVHD组尾静脉注射异种骨髓有核细胞与脾脏单个核细胞混合液0.5 mL;脐带干细胞组尾静脉注射异种骨髓有核细胞、脾脏单个核细胞与人脐带间充质干细胞混合液0.5 mL;胎盘干细胞组尾静脉注射异种骨髓有核细胞、脾脏单个核细胞与人胎盘间充质干细胞混合液0.5 mL。移植后11 d,进行GVHD临床症状评分;移植后3周,进行生存时间分析;移植后2周,进行皮肤、肝脏及小肠病理组织学分析。结果与结论:(1)体外实验:与脐带间充质干细胞相比,胎盘间充质干细胞具有更强的抗炎功能;(2)动物体内实验:脐带干细胞组、胎盘干细胞组GVHD临床症状评分低于急性GVHD组(P<0.05),小鼠存活率高于急性GVHD组(P<0.05)。急性GVHD组、胎盘间充质干细胞组和脐带间充质干细胞组均未发生皮肤组织病变,各组均可见小肠组织黏膜脱落病变,组间差异不明显;急性GVHD组小鼠肝脏组织可见多发性灶性坏死和大量炎症细胞浸润,胎盘干细胞组和脐带干细胞组仅见小的坏死病灶和较少的炎症细胞浸润;(3)结果表明,脐带和胎盘间充质干细胞均可预防小鼠急性GVHD,两者之间未见明显差异。

mda7-/IL2-4和IL2-4delE5诱导急性髓系白血病细胞向单核细胞分化

目的:研究人黑素瘤分化相关基因-7(melanoma differentiation associated gene-7,mda-7;又称IL-24)及其剪接体IL-24 delE5与急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)细胞分化的关系。方法:十四烷酰佛波醇-乙酯(12-O-tetrade-canoylphorbol-13-acetate,TPA)处理人急性髓系白血病细胞系U937、HL-60,real-time PCR及Western blotting检测细胞中mda-7/IL-24和IL-24 delE5的表达,FACS检测细胞表面CD11b、CD14和CD115的表达。siRNA干扰U937、HL-60细胞中mda-7/IL-24和IL-24 delE5的表达后,再以TPA诱导细胞分化,FACS检测CD11b、CD14和CD115的表达。用前期构建的mda-7/IL-24和IL-24 delE5载体转染U937、HL-60及AML-M5患者的原代白血病细胞,观察异位过表达mda-7/IL-24和IL-24 delE5能否诱导白血病细胞向单核细胞分化。结果:TPA在诱导U937、HL-60细胞向单核细胞分化过程中显著促进mda-7/IL-24及其剪接体IL-24 delE5的表达,用siRNA干扰mda-7/IL-24及IL-24 delE5的表达后,TPA诱导U937、HL-60细胞向单核细胞分化的作用也被阻断。异位过表达mda-7/IL-24和IL-24 delE5可诱导U937、HL-60以及原代AML细胞向单核细胞分化:U937、HL-60细胞表面CD11b和CD14表达均显著升高,CD115表达仅在U937细胞有显著升高;3例AML-M5患者的原代AML细胞中CD11b、CD14及CD115表达均有不同程度升高,细胞呈现单核细胞的形态特征。结论:TPA可通过上调mda-7/IL-24及其剪接体IL-24 delE5的表达诱导白血病细胞向单核细胞分化。

贴壁法和密度梯度离心法分离经血源性子宫内膜间充质干细胞的比较研究

目的：比较贴壁法和密度梯度离心法对经血源性子宫内膜间充质干细胞（MB-MSCs）的分离效果。方法：选择25～35岁月经周期正常的健康女性的月经血，分别采用贴壁法和密度梯度离心法分离MB-MSCs并进行传代。镜下观察原代细胞形态变化；对比原代及第2、3代细胞传代时间；流式细胞仪检测表面标志物；阿尔辛兰染色检测其成软骨能力。结果：贴壁法分离的原代细胞呈聚集样生长，密度梯度离心法分离的原代细胞6 d后也呈聚集样生长。贴壁法分离原代细胞的传代时间（14.58±1.31）d明显快于密度梯度离心法（19.17±1.34）d，差异有显著意义（P〈0.05）；第2、3代细胞的传代时间两种分离方法差异无统计学意义（P〉0.05）。经流式细胞仪检测，两种方法分离的MB-MSCs阳性表面标志物CD44、CD29、CD105、CD73含量和阴性表面标志物CD31、CD45含量比较差异无统计学意义（P〉0.05），两种方法分离的第3代细胞经成软骨诱导后比较无显著差别。结论：采用贴壁法与密度梯度离心法分离MB-MSCs效果相似，但贴壁法更适用于早期快速获得纯度较高的细胞。

巨噬细胞炎性蛋白-1α促进急性髓细胞白血病细胞生长

背景:巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)是趋化因子CCL家族中的一员,主要参与炎性反应中中性粒细胞的渗出,同时在许多恶性血液肿瘤中扮演着危险因素的角色。目的:探讨MIP-1α对AML细胞增殖的影响。方法:以MLL-AF9诱导的小鼠急性髓细胞白血病(AML)为模型,流式细胞术检测小鼠白血病发病进程及白血病干细胞比例变化;实时定量荧光PCR技术检测AML小鼠全骨髓和全脾脏细胞中MIP-1α基因的表达水平;采用集落形成实验(CFC)和体外培养AML细胞并进行细胞计数的方法检测AML细胞的增殖能力;应用小分子拮抗剂从治疗角度干预MIP-1α与其受体CCR1作用,检测阻断MIP-1α作用后对AML增殖及致病力的影响。结果:MIP-1α可以促进AML细胞增殖和集落形成,阻断MIP-1α作用可抑制AML细胞增殖并延缓AML发病。结论:MIP-1α对于AML的发生发展具有促进作用,可作为AML潜在的治疗靶点。

真性红细胞增多症患者骨髓间充质干细胞体外造血支持功能研究

目的研究真性红细胞增多症(PV)患者骨髓间充质干细胞(BMSC)的造血支持功能。方法从PV初诊患者和健康志愿者骨髓单个核细胞中分离培养BMSC;光学显微镜观察细胞形态;流式细胞术鉴定细胞免疫表型;诱导成骨及成脂分化鉴定细胞多向分化能力;与人脐带血CD34+造血干祖细胞(HSPC)共培养检测真性红细胞增多症患者来源的骨髓间充质干细胞(PV-BMSC)的体外造血支持功能。结果 PV-BMSC的细胞形态、免疫表型与正常人来源的骨髓间充质干细胞(NM-BMSC)相比无明显差异;油红O及Von Kossa染色表明PV-BMSC具有成脂和成骨分化能力;实验共分离得9株PV-BMSC,其中55%的PV-BMSC既能支持总细胞增殖,又能支持CD34+HSPC扩增(≥1.5倍,n=5),22%的仅支持总细胞增殖(≥1.5倍,n=2),其余的既不支持总细胞增殖也不支持CD34+HSPC扩增(≤1.0倍,n=2)。结论 PV-BMSC支持CD34+HSPC增殖存在明显的个体差异。

IL-34对人急性单核细胞白血病细胞恶性生物学行为的影响

目的:探讨过表达IL-34对急性单核细胞白血病(acute monocytic leukemia,AMo L)细胞恶性生物学行为的影响。方法:构建IL-34过表达载体,制备慢病毒载体p CDH-GFP,感染AMo L细胞系THP1和MOLM-13,通过细胞增殖实验、集落形成实验、PI染色检测细胞周期法和Annexin-V/PI法检测IL-34对AMo L细胞的增殖、集落形成、细胞周期和凋亡的影响,通过流式细胞术分析过表达IL-34对细胞分化表型的影响,通过裸鼠皮下成瘤模型观察肿瘤大小、质量差异和巨噬细胞募集情况。结果:实验组THP1和MOLM-13细胞IL-34 m RNA表达水平分别比对照组提高近4 000倍和近3 000倍(均P<0.01),表明已成功构建稳定过表达IL-34的AMo L细胞系。体外细胞实验结果显示,过表达IL-34提高THP1和MOLM-13细胞的增殖[72 h:(0.738±0.003)vs(0.646±0.008),(0.290±0.004)vs(0.247±0.004);均P<0.01]和集落形成能力[(127.00±3.37)vs(86.00±4.08)个,(160.70±4.70)vs(116.70±3.93)个;均P<0.01],对细胞的凋亡没有显著影响(均P>0.05);单核-巨噬细胞分化标志物CD11b和CD14表达水平升高,未成熟细胞标志物CD71表达水平减低,表明IL-34促进了AMo L细胞向单核-巨噬细胞方向分化(均P<0.05)。裸鼠体内荷瘤实验可见,过表达IL-34促进瘤组织内巨噬细胞募集(P<0.01)。结论:过表达IL-34提高AMo L细胞的增殖和集落形成能力,促进细胞向单核-巨噬细胞分化,并促进肿瘤内巨噬细胞的募集。

GADD45g基因在急性髓系白血病细胞中的低表达及其抑癌特性

目的:检测生长阻滞和DNA损伤诱导蛋白45g(growth arrest and DNA damage inducible protein 45g,GADD45g)基因在急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者骨髓标本和细胞系中的表达情况及其表达水平与AML患者预后的关系,探究过表达GADD45g对AML细胞增殖、凋亡、衰老、周期、分化和药物敏感性的影响。方法:选取中国医学科学院血液病医院2013年1月至2016年12月初次诊断为AML患者的骨髓标本共27例,用Real-time PCR和Western blotting检测AML患者、正常对照骨髓单个核细胞以及AML细胞系中GADD45g mRNA和蛋白水平的表达情况。在两个相互独立的数据集GSE10358和GSE425-GPL317中分析GADD45g表达与AML患者的总生存率(overall survival,OS)和无事件生存率(event-free survival,EFS)的相关性。构建GADD45g过表达慢病毒并感染AML细胞系U937、THP-1和Molm-13,通过生长曲线、集落形成、β-半乳糖苷酶染色、流式细胞术分析Annexin V/7AAD染色和PI染色等方法分析GADD45g过表达对AML细胞增殖、克隆形成、衰老、凋亡、周期、分化和化疗药物敏感性的影响。结果:GADD45g在AML患者和AML细胞系中的表达水平显著低于正常对照(均P<0.01)。低表达GADD45g的AML患者的OS(P<0.05)和EFS较高表达患者显著缩短(均P<0.05)。在AML细胞系中过表达GADD45g能显著抑制细胞增殖、集落形成,显著促进细胞的凋亡、衰老、周期阻滞和分化,增强了细胞对化疗药物敏感性(P<0.05或P<0.01)。结论:GADD45g基因在AML患者骨髓组织和AML细胞系中低表达,对AML细胞系有显著的全方位的抑制作用,其表达水平对AML具有预后判断价值。

敲除ADAR1抑制Notch1诱导小鼠T淋巴细胞白血病的发生

目的:探索ADAR1对于小鼠急性T淋巴细胞白血病(T cell acute lymphoblastic leukemia,T-ALL)发生发展的影响。方法:通过杂交繁殖获得Lck-Cre;ADAR1^(lox/lox)小鼠及对照组ADAR1^(lox/lox)小鼠;采用免疫磁珠法富集两组小鼠的lin-细胞,用携带MSCV-ICN1-IRES-GFP质粒的逆转录病毒分别感染上述lin-细胞,流式细胞术检测感染效率,分选并移植相同数量的GFP+细胞至受体小鼠中。在移植后持续观察并统计两组小鼠生存情况。结果:成功获得了T细胞特异敲除ADAR1的小鼠,并成功建立了Notch1诱导的小鼠T-ALL白血病模型。对照组小鼠在移植后发病,符合T-ALL特征;相反,ADAR1敲除组小鼠没有发生白血病。结论:ADAR1在Notch1诱导的T-ALL白血病的发生过程中起关键作用。

ABCB5和MDR1对急性髓系白血病耐药的影响

目的探讨ABCB5和MDR1在急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)干祖细胞系KG1a和来源于AML病人标本中的表达及对白血病耐药的影响。方法 FACS和Western blot的方法检测KG1a细胞表面ABCB5及MDR1蛋白表达产物P-gp的表达水平;利用lipo2000转染siRNA的方法瞬时干扰ABCB5的表达;FACS检测细胞内Rhodamine123的蓄积;MTT法确定维拉帕米(verapamil,Vera)对KG1a的无毒剂量,并检测KG1a、siABCB5-KG1a及联用无毒剂量维拉帕米的KG1a对阿霉素(adriamycin,ADR)的敏感性;Real time-PCR的方法检测AML病人标本中ABCB5及MDR1的表达水平。结果 KG1a高表达ABCB5和P-gp,Pgp表达量高于ABCB5;siABCB5瞬时干扰可以降低KG1a中ABCB5的表达水平,进而增加KG1a细胞中Rhodamine123的蓄积;siABCB5-KG1a对阿霉素的敏感性提高8.6倍;而联用无毒剂量维拉帕米使KG1a对阿霉素的敏感性提高67.4倍。ABCB5在71例AML临床标本中的表达水平明显高于健康组,其中在38例复发或难治型病例中的表达水平明显高于其余33例化疗敏感型病例(P<0.01),且ABCB5的mRNA表达水平与MDR1呈正相关。结论 ABCB5与已知的P-gp相同,也参与介导AML的多药耐药,这为复发及难治的AML病例的临床治疗提供新的潜在靶点。

IL-34在巨噬细胞分化中的作用研究

目的:探索IL-34与M-CSF在诱导骨髓细胞向巨噬细胞分化以及巨噬细胞表型维持中的异质性作用。方法:小鼠骨髓细胞经不同方案培养后,观察细胞形态并计数;流式分析巨噬细胞比例、分化标记物表达水平和细胞凋亡水平;RT-PCR检测巨噬细胞极化相关基因的表达水平。结果:与M-CSF比较,IL-34诱导巨噬细胞在形态、比例和绝对数差异均无显著统计学意义;分化标记物CD11b和F4/80的平均荧光强度(MFI)显著降低(均P<0.05);极化相关基因IL-1β、IL-10和iNOS的表达水平显著升高(均P<0.05),IL-12β表达降低(均P<0.05)。结论:IL-34可诱导骨髓细胞向巨噬细胞分化,促进巨噬细胞增殖的能力与M-CSF相似;促进巨噬细胞分化相关标记和极化相关基因表达与M-CSF存在显著差异。

Rictor在胚胎期肝脏造血干细胞中的作用研究

目的:观察Rictor在血细胞特异敲除后对胎肝造血的影响。方法:取实验组Vav-Cre;Rictorf/f小鼠和对照组Rictorf/+或Rictorf/f小鼠E12.5 0.08ee胎肝细胞进行骨髓重建移植实验,观察Rictor敲除对造血干细胞重建造血能力的影响。同时,实验组和对照组小鼠分选E14.5胎肝细胞0, 10, 20, 40, 60, 80个造血干细胞进行极限稀释移植实验,检测Rictor敲除后具有重建造血能力的造血干细胞的数量。进一步进行细胞周期实验以及流式细胞术分选E12.5通过一次移植成功重建造血的供体细胞进行二次移植实验,检测Rictor敲除对造血干细胞自我更新能力的影响。结果:骨髓重建造血实验结果显示,移植后4个月对照组Rictorf/+或Rictorf/f 8只受体小鼠全部重建造血功能,重建率为77.2%±11.1%,每个胎肝有57个LT-RU,实验组Vav-Cre;Rictorf/f 8只受体全部重建,重建率为37.0%±16.3%,每个胎肝8个LT-RU。极限稀释移植实验显示,移植后4个月对照组每17个SLAM细胞,实验组每39个SLAM细胞有1个具有重建造血能力的造血干细胞。二次移植实验证明,每只受体移植4×10~5供体细胞,1个月后对照组4只受体有2只重建,实验组0只重建。并且进一步证明实验组S/G2/M期细胞比率增加。结论:在胎肝造血过程中,特异敲除血细胞Rictor会导致重建造血能力降低,具有重建造血能力的造血干细胞数量下降,造血干细胞自我更新能力降低。

小鼠造血各系细胞中氧化还原酶差异表达的研究

造血细胞来源于造血干细胞(HSC),而HSC分化呈明显等级关系。细胞中活性氧簇(ROS)对HSC维持至关重要,细胞内过多ROS会造成HSC衰老。细胞主要通过氧化还原酶以及抗氧化物调节胞内ROS水平达到稳态,从而避免过多的ROS对细胞损伤。细胞内的氧化还原酶有多种,包括过氧化氢酶(catalase)、锰-超氧化物歧化酶(MnSOD)、谷胱苷肽过氧化物酶(GPX1)、NQO1〔NAD(P)H dehydrogenenasequinone 1〕和硫氧还蛋白还原酶(TXNRD1),其在呈等级分化的各类血细胞中的活性及其在这些细胞中参与ROS水平的调节作用还不清楚。本研究应用流式细胞分选技术,分选出小鼠造血各系细胞,用半定量实时PCR法检测氧化还原酶基因(Catalase、MnSOD、GPX1、Txrnd1和Nqo1)在造血各系细胞中的表达,进而筛选出参与HSC中ROS调控的重要的氧化还原酶。结果表明,以长期HSC(LT-HSC)作为参照,T细胞中catalase基因表达是LT-HSC的0.14倍,显著减低(P<0.05)。CLP和髓系细胞中MnSOD基因的表达分别是LT-HSC的0.56和0.47倍,显著减低(P<0.05)。ST-HSC、GMP和髓系细胞中GPX1基因表达分别为LT-HSC的1.79、2.96和2.07倍,显著增加(P<0.05);MEP、T淋巴细胞和B淋巴细胞中GPX1基因表达分别为LT-HSC的0.58、0.10和0.6倍,显著减低(P<0.05)。ST-HSC、MPP、CMP、GMP和髓系细胞中Txrnd1的表达分别为LT-HSC的3.36、3.18、4.19、6.39和4.27,显著增加(P<0.05);T淋巴细胞和B淋巴细胞中Txrnd1的表达分别为LT-HSC的0.016和0.56倍,显著减低(P<0.05)。ST-HSC、MPP、CMP、GMP、CLP和B淋巴细胞中Nqo1的表达为LT-HSC的0.30、0.17、0.25、0.10、0.04和0.01倍,显著减低(P<0.05)。结论:氧化还原酶在造血各系细胞的表达差异较大,提示在不同细胞中发挥主要作用的氧化还原酶种类不同。更为重要的是,Nqo1在LT-HSC中表达明显高于其他各系,提示其可能通过调控Nqo1的表达调节HSC功能。

抗氧化小分子化合物体外扩增人造血干细胞的筛选和验证研究

目的:基于LKT实验室抗氧化小分子化合物库,筛选人造血干细胞(HSC)体外扩增效果最佳的小分子化合物,并初步验证其对人HSC生物学功能的影响。方法:采用MACS磁珠富集脐带血CD34^+细胞,体外加药培养1周后应用BD Fortessa高通量流式细胞术检测CD34^+细胞及CD34^+CD49f^+细胞的绝对数和比例,以SR1(1μmol/L)为阳性对照,筛选出多个候选化合物。对候选化合物浓度、安全系数、扩增效果等多方面因素进行综合考量后,选出C2968、D3331、B1753、B3358 4个化合物进行后续实验。通过浓度梯度分析初步确定4个化合物的最佳使用浓度,并在此浓度下进行CFC体外短期造血集落形成实验,以验证化合物对人HSC自我更新、多向分化两大生物学功能的影响。结果:应用高通量流式细胞术检测85种抗氧化小分子化合物,筛选得到对人CD34^+细胞及CD34^+CD49f^+细胞具有显著扩增作用的4种化合物C2968、D3331、B1753、B3358。通过体外多浓度梯度稀释培养后,应用流式细胞术检测确定其最佳使用浓度,分别为C2968(0.5μmol/L)、D3331(1.5μmol/L)、B1753(1.5μmol/L)、B3358(15μmol/L)。体外短期造血集落形成实验结果显示,化合物处理组较对照组集落形成数量明显增多,多能祖细胞多向分化潜能得以维持。结论:C2968、D3331、B1753、B3358 4种抗氧化小分子化合物在维持人HSC自我更新的同时能够保证其多向分化潜能,具有较好的体外扩增效果。