筋脉通含药血清对高糖培养施万细胞8-羟基脱氧鸟苷和活化的caspase-3表达的影响

目的探讨筋脉通含药血清对高糖培养施万细胞8-羟基脱氧鸟苷(8-hydoxydeoxyguanosine,8-OHdG)水平及活化的半胱氨酸天冬氨酸酶3(cysteine aspartase-3,caspase-3,)(17kDa)蛋白及mRNA表达的影响。方法将体外培养的施万细胞分为高糖组、筋脉通组(加入筋脉通含药血清)、维生素C组(加入维生素C含药血清)及正常对照组,采用酶联免疫吸附法检测施万细胞上清液中8-OHdG的分泌量,免疫荧光法检测活化的caspase-3(17kDa)蛋白表达,实时荧光定量PCR法检测活化的caspase-3(17kDa)mRNA的表达。结果与正常对照组比较,高糖培养施万细胞上清液中8-OHdG的分泌量及细胞内活化的caspase-3(17kDa)蛋白和mRNA表达均明显升高(P<0.01);与高糖组比较,筋脉通组细胞上清液中8-OHdG的分泌量及细胞内活化的caspase-3(17kDa)蛋白和mRNA表达明显降低(P<0.01)。结论筋脉通含药血清可改善高糖导致的施万细胞DNA氧化损伤和细胞凋亡,提示筋脉通可能改善糖尿病神经病变之氧化损伤及细胞凋亡。

大鼠心肌微血管内皮细胞缺氧模型的建立

目的对大鼠的心肌微血管内皮细胞(myocardial microvascular endothelial cells,MMVECs)离体培养方法进行改良,建立该细胞的缺氧模型。方法取出7日龄左右的Wistar大鼠的心脏,用胰蛋白酶和胶原酶二次消化法获得MMVECs,密度梯度离心法纯化细胞,计算细胞纯度;用免疫细胞化学方法检测微血管内皮细胞特异性第Ⅷ因子、CD34及CD31相关抗原;将原代培养的细胞置于持续通入体积分数为1%O2、5%CO2和94%N2的自制缺氧装置中,并在37℃孵箱中分别缺氧处理4、6、12、18、24h,各时间段均设置正常对照组;用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色实验检测缺氧对大鼠MMEVCs增值活力的影响,Hoechst33342染色观察缺氧诱导该细胞凋亡形态学变化。结果细胞形态特征及相关抗原检测证实:与仅用二次消化法培养细胞相比,密度梯度离心纯化后所得MMVECs纯度提高(P<0.01);MTT比色实验:随着培养时间的延长,与正常对照组相比,各缺氧组OD值均有所降低,其中缺氧12、18和24h的OD值降低显著(P均<0.01);从缺氧12h开始,各缺氧组的OD值逐渐降低,与12h相比均有显著差异(P<0.01或P<0.05);Hoechst33342染色:缺氧12h细胞开始出现核固缩、碎裂、蓝色浓染等典型的凋亡形态学变化,随着缺氧时间延长该变化更为明显。结论该原代离体培养方法可以获得纯度较高的MMVECs;缺氧对MMVECs的增殖有抑制作用,本方法可以简便、有效地建立MMVECs的缺氧模型。

胚胎大鼠背根神经节神经元的原代培养

目的原代培养胚胎大鼠背根神经节神经元(DRGn),并观察其生长特性。方法取E15 SD胎鼠的背根神经节,用胰蛋白酶消化法分离成单细胞,通过密度梯度离心法和差速贴壁法进行分离纯化,在无血清培养基中培养,用抗神经元特异性烯醇化酶(NSE)抗体鉴定神经元。结果纯化培养神经元生长状态良好,纯度可达93%左右。结论该方法具有较好的可操作性和可重复性,用于DRGn的相关实验研究。