mTORC2功能及其在血液肿瘤中作用的研究进展

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体(mammalian target of rapamycin complex,mTORC)是细胞生长、存活、代谢的重要调控中心,它对维持生命有机体的正常生理活动和内稳态的平衡有着重要作用。mTORC根据其蛋白组份可分为mTORC1和mTORC2。mTORC2的主要组成蛋白有mTOR、Rictor、mLST8、Deptor、mSin1、Protor和Hsp70。mTORC2通过作用于Akt,PKCα和SGK1等来调控多项生命活动,如胚胎发育,细胞骨架重建,细胞迁移,蛋白质翻译和修饰等。mTOR信号通路异常已被证实与肿瘤相关,同时发现多种肿瘤发生与mTORC2及其异常调节信号通路相关。因此,对mTORC2组成、功能以及参与的信号通路的研究,可能为进一步研制其相关的靶向抑制药物乃至肿瘤治疗提供新思路。本综述将介绍mTORC2的组成结构、功能、参与的信号通路,及其在血液肿瘤中作用的研究进展。

STAT5在造血调控及相关血液疾病发生中的作用

信号转导与转录活化因子5(STAT5)是一种广泛存在于多种组织细胞胞浆内的转录因子,在被激活后能够进入细胞核与特异性DNA序列结合,从而发挥转录调控作用。STAT5有STAT5A和STAT5B两种异构体,二者具有96%的同源性,但其生理功能并不完全相同。研究显示,STAT5能够调节造血细胞的生存、增殖、分化和凋亡,它的过度激活与多种血液系统恶性疾病的病理发生过程密切相关,所以STAT5在临床上可能成为一个新的治疗靶点。本文就该分子在造血调控及相关血液疾病中发挥的作用加以阐述。

慢性淋巴细胞白血病的临床研究进展——2009美国血液学年会深度报道

一年一度的美国血液学（ASH）年会是国际血液学界的盛事，也日益受到我国血液学工作者的重视。我们总结了2009年度（第51届）ASH会议上报道的慢性淋巴细胞白血病（CLL）的临床研究，以使国内医师熟悉国际CLL的最新治疗研究现状。

肿瘤相关基因chp2在白血病细胞中表达的研究

为了探讨人类肿瘤相关基因chp2在白血病原代细胞和白血病细胞系中表达的特点,选择24例白血病患者、4种白血病细胞系及10名正常人外周血单个核细胞(PBMNC),用实时定量PCR(RQ-PCR)方法检测chp2基因的表达水平。结果显示,10例正常对照细胞chp2mRNA的表达检出率为80%,阳性的表达量为(0.744±0.682)×105cpsμ/。l白血病原代细胞和白血病细胞系chp2mRNA的表达量较正常对照组明显增高(p<0.05),原代细胞中的7例急性髓细胞白血病(AML)、6例慢性髓细胞白血病(CML)、7例急性淋巴细胞白血病(ALL)和4例慢性淋巴细胞白血病(CLL)的表达量分别是(11.637±5.588)、(6.122±3.785)、(4.262±2.561)和(3.434±1.974)×105cpsμ/l;白血病细胞系中K562细胞、Jurkat细胞、HL-60细胞和M07e细胞的表达量为(5.243±1.852)、(4.463±1.621)、(4.137±1.837)和(2.578±1.137)×106cpsμ/l,白血病细胞系的表达量高于原代细胞。结论:人类肿瘤相关基因chp2在白血病原代细胞和白血病细胞系中表达水平明显增高,提示其在白血病细胞生长过程中发挥着重要的作用。

NQO1C_(609T),RAD51_(G135C)和XRCC3_(C241T)单核苷酸多态性与急性淋巴细胞白血病发病相关性研究

本研究探索NQO1C609T,RAD51G135C和XRCC3C241T单核苷酸多态性与急性淋巴细胞白血病(ALL)发生的关系。对170例ALL患者和458名与患者无血缘关系的正常人,用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)方法分析其NQO1C609T,RAD51G135C和XRCC3C241T基因型。结果表明:在单基因水平分析时NQO1C609T,RAD51G135C和XRCC3C241T基因型比例在正常对照和ALL患者之间无统计学差异,提示其单独作用时对ALL发病的影响无统计学意义。当3个基因联合分析时,NQO1C609T和RAD51G135C均为变异型时伴髓系抗原阳性的ALL和伴平衡易位ALL的发病风险增加(OR值分别为5.553和2.618);NQO1C609T纯合变异型时农村儿童ALL的发病风险增加(OR值为2.541)。结论:NQO1C609T、RAD51G135C和XRCC3C241T基因型联合作用可能促进ALL的发病,提示多基因联合分析较单基因对ALL的发病分析可能更有预测意义。

Numb在白血病细胞系K562中的表达及不对称分裂研究

目的:以白血病细胞系K562为研究对象,通过观察分化与未分化的K562细胞中Numb的表达改变以及不对称分裂规律的变化,探讨不对称分裂改变在白血病细胞中的作用。方法:氯化高铁血红素(Hemin)诱导K562细胞分化,实时荧光定量RT-qPCR和流式细胞术分别检测K562细胞分化后Numb表达的改变。诺考达唑使细胞处于同步化水平,免疫组织化学技术标记Numb蛋白,应用共聚焦显微镜观察处于分裂末期的细胞,再使用Image J软件计算细胞的荧光强度,根据分裂后2个子细胞的荧光强度统计各分裂方式的比例。结果:在诱导K562细胞分化过程中,Numb mRNA水平较对照组上调了2.3倍(P<0.001);流式细胞术分析显示,分化的K562细胞中Numb阳性率为(67.37±5.01)%,而未分化的K562细胞中Numb阳性率为(43.97±5.72)%(P<0.01),并且分化的K562细胞比未分化的K562细胞不对称分裂比例增加了18.3%,对称性自我更新比例减少了49.7%(P<0.001),对称性向下分化比例增加了32%(P<0.001)。结论:分化的K562细胞中Numb的表达上调,不对称分裂的比例比未分化的增多;当诱导其分化时,不对称分裂增加,对称性自我更新减少。白血病细胞主要是通过对称性自我更新方式进行分裂以维持白血病细胞的稳定。

序列特异性短发夹状RNA逆转白血病多药耐药性研究

本研究旨在构建并筛选MDR1序列特异性短发夹状RNA干扰载体,研究其对K562/A02细胞的影响。采用脂质体介导方法,将含mdr1-sh RNA质粒转入K562/A02细胞,经G418筛选得到稳定表达细胞株,用实时定量RT-PCR和Western blot分别检测干扰后mdr1 mRNA水平及蛋白水平的表达变化,通过CCK8测定干扰后细胞对化疗药的敏感性变化,Rhodamine123外排实验检测P-gp功能的变化。结果发现:与对照组相比,4种MDR1-sh RNA载体均能显著下调P-gp的表达,其中508-526靶位点的shRNA作用效果最好。结论:筛选得到的MDR1-sh RNA载体能够显著下调MDR1的表达,逆转耐药表型,为后续进行的动物实验研究创立了条件。

富甘氨酸寡核苷酸抗白血病细胞增殖作用的研究

富甘氨酸寡核苷酸(G-rich oligonucleotides,GROs)是一类新型的磷酸二酯寡核苷酸,可以形成G-四聚体(G-quartet)结构,能诱导多种白血病细胞系的细胞周期停滞于S期,通过非反义途径发挥抑制生长作用。本研究旨在探讨GRO-26B对白血病细胞系的增殖抑制及对细胞周期和形态的影响,并探讨相关机制。采用MTT法检测细胞增殖情况;流式细胞术分析细胞周期改变;Western blot观察细胞周期调控相关蛋白的表达变化;光学倒置显微镜及透射电镜观察细胞形态及超微结构改变。结果表明,实验药物GRO-26B对髓系白血病细胞系如U937、NB4等起作用,抑制细胞增殖,诱导细胞周期停滞于S期,进而导致细胞死亡。对淋巴细胞系如Jurkat、Nalm6的增殖抑制作用不明显,GRO-26B处理后可观察到细胞体积明显变大,部分细胞内可见大量空泡,部分晚期细胞皱缩,细胞核碎裂,逐渐死亡裂解。电子显微镜下超微结构变化更明显。GRO-26B处理的U937细胞周期蛋白B1表达下降(处理24小时即开始下降,72小时更加明显);CDC2表达增加。周期蛋白A、CDK2培养24小时表达无明显变化,72小时则不同程度升高。结论:GRO-26B明显抑制髓系白血病细胞系U937、NB4等的增殖,诱导细胞周期停滞于S期,细胞周期的停滞与细胞周期蛋白/细胞周期蛋白依赖激酶(CDK)有关。

新药时代年轻的多发性骨髓瘤患者的治疗选择——2009美国血液学会年会深度报道

第51届美国血液学会（ASH）年会中，作为重要热点之一，超过800篇的摘要涉及多发性骨髓瘤（MM）的临床和基础研究。在此，对会议中有关年轻（〈65岁）而适合造血干细胞（HSCT）移植的MM患者的主要研究结果进行总结。

重组人凝血因子Ⅶa治疗血液病患者出血的临床疗效分析

目的研究重组人凝血因子Ⅶa（rFⅦa）治疗血液病患者出血的疗效。方法回顾性分析rFⅦa治疗31例血液病患者共38次出血的临床资料。结果rFⅦa治疗获得性血友病A（AHA）/血友病伴抑制物、急性早幼粒细胞白血病（APL）、急性非APL白血病患者出血的总体有效率分别为90%（9/10）、71.4%（5/7）、60.0%（3/5），高于造血干细胞移植后患者（30.8%）；rFⅦa治疗评分为2分出血的有效率（100.0%）高于3分（66.7%）及4分（51.6%）出血；5例次颅内出血中2例次（25.0%）有效；9例次血尿中6例次（66.7%）有效；12例次消化道出血中5例次（41.7%）有效。3例次关节及肌肉出血的疗效均为极好，5例次出血部位为皮肤、鼻黏膜、咽部及齿龈，疗效均为极好；移植后患者在出血评分为4分时，高剂量以及多次使用rFⅦa并不一定能取得好的疗效。AHA/血友病伴抑制物及急性白血病患者合并的出血，在评分为4分时，使用低剂量rFⅦa能取得好的疗效，但最低用药剂量（22.5 μg/kg）的疗效差。结论rFⅦa的止血疗效受疾病类型、出血部位以及严重程度等多个因素的影响。rFⅦa对AHA/血友病伴抑制物以及急性白血病患者的出血具有较好的疗效，但对移植后患者的出血疗效欠佳。出血早期使用rFⅦa对于疗效至关重要。在止血治疗的同时，应积极治疗基础疾病。

基于常规实验室检查指标的改良WPSS预后积分系统对骨髓增生异常综合征预后判断意义的初步研究

目的评价WPSS预后积分系统在我国骨髓增生异常综合征（MDS）患者预后判断中的作用，并对常规实验室检查指标用于MDS患者预后判断进行初步研究。方法对染色体核型结果可供分析的164例成人原发MDS患者进行回顾性分析。结果164例患者中位随访时间19（1—138）个月，中位生存（MS）期36个月，2年预期生存（PS）率60％，5年PS率42％。按WPSS评分，极低危组、低危组、中危组、高危组和极高危组的2年PS率分别为100％、96％、81％、38％和14％，5年PS率分别为100％、83％、54％、20％和0，Log—rank检验各组总体生存（OS）率差异有统计学意义（P〈0．01）。常规实验室检查中，Hb≥80g/L、平均红细胞体积（MCV）升高（〉95fl）、平均红细胞血红蛋白含量（MCH）升高（〉32pg）、BPC≥100×10^9／L的患者预后较好；骨髓原始细胞比例（Blast）≥0．05的患者较〈0．05的患者预后差，骨髓细胞发育异常≥2系的患者预后较差；细胞组化检查中性粒细胞碱性磷酸酶（N-ALP）阳性指数升高（〉173．21）、有核红细胞糖原染色（E—PAS）阴性的患者预后较好，小巨核酶标染色可见淋巴样小巨核细胞（MEGly）的患者预后较差。另外，血清乳酸脱氢酶水平升高（≥300U／L）的患者预后较差。将上述单因素分析有预后意义的参数纳入COX多因素模型筛选，MCV、MEGly、Blast具有独立预后意义（P值分别为0．011、0．013、0．016）。选取MCV、MEGly及WHO分型提出改良的WPSS积分系统，低危组、中危组、高危组患者的2年PS率分别为94％、68％和49％，5年PS率分别为86％、53％和14％，经Log—rank检验各组OS率差异有统计学意义（P〈0．01）。结论与WHO分型相适应的WPSS适合用于判断我国MDS患者的预后。采用常规实验室检查指标中的MCV、MEGly及WHO分型提出的改良WPSS积分系统可望提供适于我国现阶段基层单位的MDS预后判断标准。

SiRNA干扰β-catenin对K562细胞在体内成瘤能力作用的研究

本研究旨在探讨β-联蛋白(β-caten in)对K562细胞体内成瘤能力的影响。采用β-caten in序列特异的siRNA下调K562细胞中靶基因β-caten in的表达,将处理后的K562细胞植入BALB/c裸鼠皮下,观察其在裸鼠皮下成瘤率及成瘤曲线。同时用未处理的K562细胞及非特异序列siRNA处理的K562细胞作为对照。结果表明,未处理组(n=9)、对照组(无关序列干扰)(n=8)和试验组(β-caten in特异性干扰)(n=9)成瘤率分别为100%、87.5%和0%,试验组成瘤率与前两组比较有显著的统计学差异(p<0.001)。未处理组瘤块体积增长略快于对照组,但2组的瘤块体积增长速度无统计学差异;在试验组未见成瘤。结论:特异性干扰下调β-caten in的表达,影响K562细胞体内成瘤。

IL-18基因启动子区单核苷酸多态性在恶性血液病患者HLA匹配同胞供者异基因造血干细胞移植中的临床意义

目的研究IL-18基因启动子区单核苷酸多态性（SNP）对恶性血液病患者HLA匹配同胞供者异基因造血干细胞移植（allo．HSCT）造血重建、并发症及生存的影响。方法93例恶性血液病患者纳人研究。采用序列特异性引物聚合酶链反应（PCR．ssP）法检测供受者IL．18基因SNP．607C／A和．137G／C，分析供受者IL．18不同基因型对患者造血重建速度、移植物抗宿主病（GVHD）发生率、感染发生率、移植相关死亡（TRM）和无病生存（DFS）率的影响。结果供者．137G／G与G／C＋C／C组比较，allo-HSCT后患者中位粒细胞重建时间较短[15（11～23）d对17（11-24）d，P=0．010]，中位血小板重建时间差异无统计学意义[20（11-46）d对20（7～38）d，P=0．844]，广泛型慢性GvHD（cGvHD）发生率较高（20．6％对3．3％，P=0．029）；供者．607C／C组广泛型cGVHD发生率高于-607C／A＋A／A组（31．6％对10．8％，P=0．024）；受者．607C／C组广泛型cGVHD发生率高于．607C／A＋A／A组（33．3％对10．7％，P=0.016）。不同供受者IL-18基因型组间复发率、TRM、DFS率差异均无统计学意义（P值均〉0．05）。结论选择IL-18．137G／G基因型供者有助于恶性血液病患者HLA匹配同胞供者allo—HSCT后粒细胞造血重建，但广泛型cGVHD发生率较高。

腺病毒递送BMI-1shRNA

近年来发展了一些质粒载体介导shRNA的转录,然后在细胞酶的作用下加工成功能性的siRNAs。虽然这些载体较化学合成的siRNA有更多的优点,但仍存在相当多的缺点,如转染效率低和不能在体内使用。本研究建立一种没有上述缺点的腺病毒递送BmihRNAs系统,设计靶向人Bmi-1的载体。以pAdTrackCMV质粒为模板扩增CMV-GFP表达盒,从pGE1BMIhRNA质粒上酶切下U6-BMI-1shRNA表达盒,克隆它们入穿梭质粒pShuttle中,然后与pAdEasy-1质粒基因重组产生腺病毒质粒pAd-BMIhRNA-CVM-GFP,转染293A包装细胞,收获病毒。病毒感染K562细胞后,在mRNA和蛋白水平上分别用RealTime-PCR和Westernblot检测BMI的表达水平。结果表明:成功构建了pGE1BMIhRNA腺病毒质粒并有效包装出病毒。感染BmihRNA腺病毒的K562细胞在mRNA和蛋白水平上均显著下调了Bmi-1的表达,而对照病毒没有明显的效果。结论:腺病毒是一种有效递送siRNA入哺乳动物细胞的载体。腺病毒递送siRNA载体可能成为siRNA药物的基因治疗载体。

慢性中性粒细胞白血病临床和实验室特征及预后因素分析

目的探讨慢性中性粒细胞白血病（CNL）患者的临床表现、细胞遗传学和基因突变等实验室特征及预后因素。 方法对符合2016年WHO诊断分型标准的16例CNL患者进行资料采集，随访患者并进行预后分析。利用直接测序法检测CSF3R、ASXL1、SETBP1、CALR、MPL基因突变状态，对有突变的样本进行克隆后测序鉴定，采用等位基因特异性聚合酶链反应（AS-PCR）检测JAK2 V617F突变。 结果16例CNL患者中位发病年龄为64（43~80）岁，男性占75%（12/16），确诊时中位HGB水平为114（81~154）g/L，中位WBC为41.20（26.05~167.70）×109/L，中位PLT为238（91~394）×109/L。中位骨髓纤维化水平为1（0~3）级。除1例t（1;7）（p32;q11）、1例＋21克隆异常及1例14ps＋外，余患者均为正常核型。16例CNL患者中，CSF3R T618I突变检出率为100%（16/16），ASXL1突变检出率为81%（13/16），SETBP1突变检出率为63%（10/16），1例患者携带CALR K385fs＊47突变，所有患者均无JAK2 V617F突变及MPL突变。CNL患者中位生存期为24（95%CI 18~30）个月。初诊WBC≥50×109/L者中位生存期较〈50×109/L者短（11个月对39个月，P=0.005）。 结论CSF3R T618I突变是CNL的特异性突变。CNL患者中位生存期24个月，确诊时WBC≥50×109/L是不良预后因素。

二甲双胍对急性早幼粒细胞白血病细胞系NB4的作用及机制探讨

本研究旨在探讨二甲双胍对急性早幼粒细胞白血病细胞系NB4细胞生物学特性的影响及可能的作用机制。采用不同浓度的二甲双胍处理NB4细胞,MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡情况,通过细胞黏附实验分析药物对细胞黏附能力的影响。采用细胞外信号调节激酶(ERK)磷酸化抑制剂U0126预处理NB4细胞,Western blot观察ERK磷酸化水平的变化,同时检测细胞凋亡和黏附能力的改变。结果表明,二甲双胍能抑制NB4细胞增殖,诱导细胞凋亡,增强细胞的黏附能力。5μmol/L U0126预处理有效抑制NB4细胞中ERK的磷酸化,降低5 mmol/L二甲双胍诱导的细胞凋亡并减弱细胞的黏附能力。结论:二甲双胍对NB4细胞有抑制增殖、促进凋亡和黏附的作用,MEK/ERK信号通路可能是二甲双胍在NB4细胞中的分子作用机制之一。

N-cadherin在维持白血病干细胞特征中的作用

自我更新和抗药性是白血病干细胞的重要特征,为阐明N-cadherin参与维持白血病干细胞特征的分子机制,本研究以CD34病细胞系KG1a为研究模型,确定N-cadherin在维持白血病细胞自我更新和抗药性中的作用。通过流式细胞仪分选出N-cadherin阳性及N-cadherin阴性两群细胞,采用集落培养及化疗药物VP16分别处理两群细胞,比较二者的体外增殖及自我更新能力,以及VP16作用于两群细胞的半数抑制浓度IC50。结果显示:N-cadherin阳性的KG1a细胞的集落形成能力显著高于N-cadherin阴性细胞。VP16作用于N-cadherin阳性细胞的IC50(220μmol/L)显著高于N-cadherin阴性细胞(151μmol/L)(p=0.04);N-cadherin介导的黏附参与了N-cadherin阳性细胞的抗药性。结论:N-cadherin在维持白血病干细胞自我更新和抗药性的特征中起重要作用。

转录因子GATA-2对iASPP基因的转录调控研究

癌基因iASPP促进细胞增殖、抑制细胞凋亡,其转录起始位点上游序列有转录因子GATA-2的假定结合位点,GATA-2在造血干/祖细胞的增殖和分化中起重要作用。本研究旨在探讨GATA-2对iASPP的转录调控作用。首先检测了部分白血病细胞系中iASPP和GATA-2蛋白的表达,然后构建带有GATA-2开放读码框的真核表达载体与带有iASPP转录起始位点上游3000 bp至下游500 bp序列中GATA-2假定结合位点的荧光素酶报告载体,共转染HEK293和CV-1细胞,检测荧光素酶活性,并对荧光素酶活性上调的结合位点区进行染色质免疫共沉淀实验。结果显示,白血病细胞系中iASPP高表达的细胞大多存在GATA-2的高表达;GATA-2对iASPP报告基因荧光素酶活性有显著影响,并呈现明显的"剂量-效应"关系。当pCMV5-GATA2转染剂量上升至100 ng时,iASPP荧光素酶活性在HEK293细胞中上调到2倍;此转录激活作用在CV-1细胞中尤为显著,荧光素酶活性上调可达6.7。染色质免疫共沉淀结果证实GATA-2与iASPP转录起始区nt-361～-334有特异性结合。结论:转录因子GATA-2可以与iASPP的转录调控区结合,并促进iASPP基因转录。

c-MPL在急性髓系白血病患者白血病干细胞中的表达

本研究通过检测c-MPL在急性髓系白血病(AML)患者骨髓细胞中的表达,探讨c-MPL表达与CD34、CD38的相关性,以确定c-MPL在白血病干细胞的表达。通过流式细胞术检测29例初诊AML患者的c-MPL和CD34、CD38阳性细胞比例;比较患者c-MPL表达水平与正常对照的差别及与临床指标的关系;分析患者的c-MPL表达水平与CD34、CD38各部分细胞分群的关系及它们之间的相关性。结果表明:AML患者骨髓细胞中c-MPL表达水平显著高于正常对照组(P<0.05);c-MPL的表达与患者的年龄、性别、白细胞计数、AML1-ETO融合基因、化疗后缓解情况无关;c-MPL在M2和M5分型中的表达显著高于正常对照组(P<0.05)。CD34阳性AML患者组的c-MPL表达水平显著高于CD34阴性AML患者组(P<0.01)。AML患者c-MPL在CD34+细胞中的表达显著高于CD34-细胞(P<0.001);AML患者中c-MPL在CD34+CD38+和CD34+CD38-两群细胞中的表达无显著性差异(P>0.05);c-MPL和CD34的表达呈正相关(r=0.380,P=0.042)。结论:c-MPL在AML患者中高表达,且与CD34的表达水平具有一定的正相关性,c-MPL表达于白血病干细胞。

用于荧光原位杂交技术的骨髓细胞制片方法研究

本研究对传统的骨髓细胞制片方法进行改良,探讨其对荧光原位杂交(FISH)信号的影响,为骨髓标本FISH检测提供最佳的制片方法。采用缺口平移的方法,制作出Spectrum Green-C-myc,Promo Fluor-555-MDM2,Promo Fluor-415-STK6三色荧光杂交探针。将采集到的5例骨髓标本进行2种方法制片,传统方法:用低渗的方法去除红细胞,甲醇/冰醋酸(3∶1)固定细胞后进行细胞甩片;改进方法:用密度梯度离心的方法去除红细胞,细胞甩片后用甲醇固定细胞,再用2%甲醛固定细胞,将固定好的细胞进行FISH检测并比较两种方法获得的平均荧光信号强度,背景信号强度以及荧光信号的分裂率。结果表明:在Spectrum Green,Promo Fluor-555和Promo Fluor-415 3个通道中,传统方法制片FISH平均荧光信号强度与背景强度的比值为4.3±0.19,3.52±0.04,3.07±0.08,改进方法为9.89±0.41,7.55±0.5,5.67±0.18,(P<0.01);改进方法在3个通道中获得的荧光信号强度分别为传统方法的2.32,2.14和1.85倍;同时该方法减少了荧光信号的分裂率,传统方法荧光信号的分裂率分别为(15.8±1.74)%,(20.42±2.88)%,(23.2±3.02)%,改进方法分别为(8.6±1.2)%,(12.28±1.33)%,(12.6±2.56)%(P<0.05)。结论:采用改进后的骨髓制片方法有效地提高了FISH检测的荧光信号强度,明显降低了荧光信号的分裂现象,而且该方法易于掌握,程序简单。本研究为FISH检测骨髓标本提供了一种更佳的制片方法。