中国山东地区妇女宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16E6E7基因的分离、克隆和序列分析

目的分析中国山东地区宫颈癌患者ＨＰＶ１６型Ｅ６Ｅ７基因结构特点。方法从中国山东地区宫颈癌活检组织中提取ＤＮＡ，经ＨＰＶ多重引物ＰＣＲ法鉴定标本中感染ＨＰＶ型别，选感染ＨＰＶ１６型的标本ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增，获得ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７基因，将其重组入ｐＡＬＴＥＲ－１载体，进行双向测序、分析。结果构建了含中国山东地区宫颈癌患者组织中ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７的重组质粒，命名为ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７－ＳＤ。ＤＮＡ序列分析表明，该序列全长７７６ｂｐ，与已发表的德国标准株长度相等，但其核苷酸顺序的第５５７位核苷酸“Ｔ”变为“Ｃ”，即Ｅ６的终止密码子ＴＡＡ变为谷氨酰胺密码子ＣＡＡ。结论中国山东地区宫颈癌患者组织中ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７的基因结构与德国标准株ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７基因之间存在差异。

单纯疱疹病毒I型糖蛋白D核酸疫苗的构建及初步研究

目的构建、制备Ⅰ型单纯疱疹病毒糖蛋白Ｄ重组质粒ＤＮＡ疫苗，初步检测其诱导机体产生体液免疫应答的效果，为研制ＨＳＶ－１新型疫苗奠定基础。方法用ＰＣＲ的方法从ＨＳＶ－１病毒基因组中扩增糖蛋白Ｄ（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｄ，ｇＤ）基因，利用基因重组技术构建重组质粒；将重组质粒体外转染真核细胞ＣＯＳ－７，Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测表达产物；于ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠后腿胫前肌注射免疫，０、２周各免疫１次，１００μｇ／次。初次免疫后０、２、４、６周眼眶采血，ＥＬＩＳＡ间接法检测抗体。结果重组质粒酶切出相应大小片段，经测序证实为ＨＳＶ－１ｇＤ序列。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ证实能够在体外真核细胞中表达。免疫小鼠后，产生特异性抗体，抗体滴度１∶２０００。结论ＨＳＶ－１ｇＤ重组质粒ＤＮＡ有可能作为ＨＳＶ－１的ＤＮＡ疫苗，用于防治ＨＳＶ－１感染及其相关疾病。

喷昔洛韦对宫颈癌细胞系抑制作用的研究

目的：喷昔洛韦９位取代鸟嘌呤化合物，在体内外对单纯疱疾病毒Ⅰ型（ＨＳＶ－Ⅰ）、Ⅱ型（ＨＳＶ－Ⅱ），带状疱疹病毒（ＶＩＶ）有良好的抑制作用。我们从基础研究入手，在细胞水平上探讨喷昔洛韦对ＨＰＶ（人乳头瘤病毒）相关细胞系的作用，为扩大此药的治疗适应症提供新的思路。方法：采用不同来源的宫颈癌细胞系ＣａＳｋｉ（ＨＰＶ１６型阳性的人宫颈鳞状上皮细胞系）、Ｈｅｌａ（ＨＰＶ１８型阳性的人宫颈腺上皮细胞系）、 Ｎ（由 ＨＰＶ１６ Ｅ６／ｅ７基因和 ＨＳＶ的 Ｎ片断共转染得到的恶性转化宫颈鳞状上皮细胞系）和２ＢＳ（人正常纤维细胞）及原代培养的正常人鳞状上皮细胞，加入不同浓度的喷昔洛韦，测定不同细胞在喷昔洛韦药物作用下的半数致死浓度（ＥＤ５０），喷昔洛韦对上述细胞的ＥＤ５０分别是２．５ × １０－３ｍｏＬ·Ｌ－１， ７·５ × １０－３ｍｇ·Ｌ－１， ２５ × １０－３ｍｇ·Ｌ－１５．０ × １０－３ｍｇ·Ｌ－１， １５．０ × １０－３ｍｇ·Ｌ－１。选择合适的喷昔洛韦浓度加到各种细胞系中，在不同时间下，用倒置显微镜观察细胞的形态结构改变及测定了各种细胞的生长速度（生长曲线），用透射电子显微镜观察了细胞的超微结构变化。结果：选择 ７．５ ×１０－?

不同微生物佐剂S180瘤苗的免疫效应和抑瘤作用

目的 比较肿瘤主动特异性免疫治疗中具有佐剂作用的白色念珠菌、李斯特菌及卡介苗的免疫调节效应和抑瘤作用。方法 选择白色念珠菌、李斯特菌、卡介苗各自联合小鼠S 180肿瘤疫苗 ,皮下免疫接种荷瘤小鼠 ,检测小鼠脾细胞IL 2、IFN 产生水平 ,腹腔MTNF α产生水平 ,观察荷瘤小鼠瘤体重量和存活期。结果 三种微生物佐剂均能协同瘤苗增强免疫小鼠IL 2、IFN 和TNF α的产生能力 (P <0 0 1,0 0 5 ) ,有效抑制足垫部移植瘤的生长 ,抑制率在 6 2 8%～ 75 8%之间 ,显著高于单独注射瘤苗组 (P <0 0 1) ,延长腹腔植瘤小鼠平均存活期 7～ 14天 ,白色念珠菌、李斯特菌协同提高腹腔植瘤小鼠存活率 2 0 %。结论 白色念珠菌和李斯特菌与卡介苗具有同样的佐剂效应 。

修饰后中国山东地方株HPV16 E6E7基因的转化活性检测及免疫原性研究

目的 利用突变修饰后消除转化活性并保留抗原性的中国山东地方株人乳头瘤病毒16型 (HPV16 )E6E7基因 ,研制HPV16DNA疫苗。方法 定点突变E6的终止密码 ,并保证E7读码框架不变 ;定点突变E7蛋白的Rb结合区中对其转化活性维持起关键作用的第 2 4位氨基酸。突变修饰后的基因命名为fmE6E7。PCR扩增fmE6E7,重组入pLNCX载体 ,脂质体法转染 3T3细胞 ,免疫荧光组织化学及Westernblot检测转染细胞蛋白的表达。经软琼脂集落培养法和BALB c裸鼠皮下接种法检测fmE6E7的转化活性。然后PCR扩增fmE6E7,构建pVR10 12 fmE6E7真核表达质粒 ,于C5 7BL 6小鼠肌肉内直接进行裸DNA免疫 ,51 Cr释放法体外分析免疫鼠的细胞毒性T淋巴细胞活性 ,间接ELISA法检测免疫鼠血清中E7特异性抗体。结果 测序证实获得了预期的突变结果。pLNCX fmE6E7转染细胞体外软琼脂培养 3周未见集落形成 ;裸鼠皮下接种 2月后未见移植瘤形成 (0 3)。免疫鼠获得了较好的E7特异性的抗体E和抗原特异性的CTL。结论 修饰后E6E7基因可融合表达 ,转化活性消除的同时还可诱发特异的细胞免疫和体液免疫 ,表明中国山东地方株的E6E7基因可作为HPV16治疗性DNA疫苗的靶基因。

白介素2基因佐剂协同单纯疱疹病毒1型糖蛋白D核酸疫苗免疫诱导的特异性免疫应答

目的研究白介素2(IL-2)cDNA协同单纯疱疹病毒1型(HSV-1)gD核酸疫苗免疫对机体体液免疫和细胞免疫应答的影响,以及在HSV-1病毒角膜攻击时的保护效果。方法利用pcDNA3.1载体分别构建HSV-1糖蛋白D和IL-2的真核表达质粒pgD和pIL-2,体外鉴定其表达。动物实验分为pcDNA3.1空载体对照组、pgD单独免疫组和pgD+pIL-2联合免疫组3组,具体为通过肌肉免疫接种BALB/c小鼠3次,间隔2周,每次接种质粒100μg,第3次免疫后2周,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗体滴度并做亚型分析,利用3H-TdR掺入法进行Th细胞增殖实验,ELISA试剂盒检测Th细胞分泌的IL-2、IFN-γ和IL-10水平,耳廓肿胀实验检测迟发型超敏反应(DTH)反应;HSV-1病毒角膜攻击后,裂隙灯显微镜观察角膜上皮病变。结果与pgD单独免疫组相比,pIL-2的协同免疫可以显著提高IgG2a抗体滴度、Th细胞增殖反应和DTH反应,Th细胞分泌IL-2和IFN-γ水平也显著提高,IL-10水平明显下降。在动物保护实验中,pIL-2的协同免疫明显增强了pgD疫苗在病毒攻击时对角膜的保护效果。结论IL-2cDNA的协同免疫可以显著提高pgD核酸疫苗诱导的体液免疫和细胞免疫应答水平,增加核酸疫苗的免疫保护效果。

尖锐湿疣患者人乳头瘤病毒6、11型的检测及L1基因的序列分析

目的 检测尖锐湿疣患者组织中人乳头瘤病毒 (HPV)6型和 11型的感染率，分析 L1晚期基因序列及其蛋白质的氨基酸序列，为基因工程疫苗的研究提供依据。方法 采用 PCR方法测定北京和锦州两地区 34例尖锐湿疣患者病损组织中 HPV6型及 11型的感染率 ,并扩增 L1晚期基因，构建重组测序质粒，双脱氧法测序观察其变异状况。结果 HPV11型感染率为 73.5％ (25/34)， 6型感染率为 44.1％ (15/34),其中两型混合感染率为 17.6％ (6/34)。 11型 L1基因 7～ 8个碱基变异，推导的蛋白质一级结构中可能有 1～ 3个氨基酸变异， 6型 L1基因仅有 3个碱基发生同义突变。结论 检测的 34例患者中以 HPV11型感染为主，兼有 6型和两型的混合感染。 11型 L1基因及蛋白有一定变异， 6型 L1基因仅发生少数碱基同义突变。

人乳头瘤病毒16型E6E7基因协同共激活分子B7-1基因免疫诱导的特异性免疫反应

目的利用突变修饰后的中国山东地方株人乳头瘤病毒16型(humanpapillomavirustype16,HPV16)E6E7融合基因(fmE6E7),研究治疗HPV16感染相关疾病的DNA疫苗,并进一步探索利用共激活分子B7-1基因,研究更加活化细胞免疫的加强疫苗。方法将用PCR法扩增获得fmE6E7基因插入真核表达质粒pVR1012中获得pVR1012-fmE6E7,瞬时转染Cos-7细胞,免疫荧光组织化学法检测证实其表达后,在C57BL/6小鼠肌肉内进行pVR1012-fmE6E7单独免疫,或与小鼠共激活分子B7-1基因真核表达质粒(pcDNA3.1-B7-1)联合免疫。51Cr释放法分析免疫小鼠的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocytes,CTL)活性,间接ELISA法检测小鼠血清中E7特异性抗体。用5×105个C3细胞皮下接种C57BL/6小鼠,分析小鼠体内诱发的特异性抗瘤免疫水平。结果修饰后的E6E7基因免疫可诱导机体产生特异的抗体反应和CTL反应,小鼠B7-1基因与fmE6E7联合免疫可显著提高特异性CTL活性,并可保护33%(2/6)的小鼠免受C3肿瘤细胞的攻击,而单独fmE6E7基因免疫则不能抑制C3瘤细胞的生长,联合B7-1基因免疫对诱发的抗体水平无加强作用。结论中国山东地方株E6E7融合基因可用于DNA疫苗的构建,B7-1基因协同免疫可提高疫苗的细胞免疫水平,利用B7-1基因作为HPV16DNA疫苗的协同因子具有重要价值。

人乳头瘤病毒6型基因组晚期区序列分析

目的初步分析我国尖锐湿疣患者病变组织分离的乳头瘤病毒6型(HPV-6)基因组晚期区编码序列变异情况。方法采用重叠PCR设计,分别从HPV-6阳性尖锐湿疣患者病变组织扩增出主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2基因片段,插入质粒载体克隆,经测序、拼接获得HPV-6基因组晚期区序列。结果得到的两条长2869bp的HPV-6晚期区序列(GenBank序列索取号AY015006,AY015008)均具有完整的L1和L2开放阅读框(ORF),与原型序列比较,在L1和L2ORF中共有9个核苷酸变异,其中错义突变4个(有3个发生在L2ORF,1个在L1ORF)。分子进化分析表明,克隆的晚期区序列属于HPV-6b亚型。结论HPV-6基因组晚期区编码序列非常保守(核苷酸变异率小于0.28%),并且L1ORF比L2ORF更为保守,其中位于L1ORF中7081位的A→G和7099位的G→A两处共有突变在我国HPV-6分离物中具有代表性。本研究首次从我国尖锐湿疣组织标本克隆了HPV-6基因组晚期区全长编码序列。

H_2O_2致WB-F344细胞内活性氧的产生及机理

以双氢罗丹明123(DHR123)作为荧光探针,采用激光共聚焦扫描显微镜研究小剂量(800 nmol/L)H2O2诱导大鼠肝卵圆细胞株WB-F344细胞内活性氧产生的动态变化过程及其机理。结果发现:(1)小剂量H2O2的一次作用可以引起胞内活性氧的产生;(2)胞内活性氧清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)处理2 h时后,再加入小剂量H2O2,发现胞内活性氧的产生明显减少;(3)用广谱的蛋白激酶抑制剂2-氨基嘌呤(2-AP)、Ca2+依赖性蛋白激酶(PKC)抑制剂Bisindolylmaleimide I、酪氨酸蛋白激酶(TPK)抑制剂Tyrphostin 25分别预处理15 min后,H2O2诱导的胞内活性氧的产生现象均消失;(4)细胞在无外钙环境下,小剂量H2O2诱导的胞内活性氧的产生明显减少;(5)细胞在无外钙环境下用NAC预处理后,H2O2诱导的胞内活性氧的产生现象消失。结果表明,H2O2可以通过胞内信号转导系统诱使WB细胞胞内活性氧产生,这可能与小剂量H2O2调控细胞生物学功能(如增殖、转化)相关。

H_2O_2对大鼠肝卵圆细胞株WB-F344细胞膜理化特性、脂质过氧化及基因组DNA的影响

目的 研究小剂量(100 nmol/L)H_2O_2对大鼠肝卵圆细胞株WB-F344细胞膜理化特性、脂质过氧化及基因组DNA的影响。方法利用标记膜脂及膜蛋白质的荧光标记物1，6-二苯基-1，3，5-己三烯(DPH)和N-(3芘)马来酰亚胺[N-(3P)M]标记不同剂量H_2O_2作用及经H_2O_2多次作用后发生转化的WB细胞，通过测定其荧光偏振度确定膜理化特性的改变；以硫代巴比妥酸(TBA)法测定其脂质过氧化产物丙二醛（MDA）含量的变化；以及利用溴化乙锭(EB)作荧光探针，通过DNA-EB结合物荧光强度的变化确定其基因组DNA的损伤程度。结果小剂量(100 nmol/L)H2O2的一次作用可使膜蛋白运动度增加，膜脂流动性增大，MDA的含量增高；H_2O_2的多次作用使上述变化更为显著。大剂量(1 mmol/L)、中剂量(100 μmol/L)的H_2O_2作用细胞后可直接损伤基因组DNA，小剂量H2O2的一次作用虽然不能直接损伤基因组DNA，但多次作用后却可使基因组DNA受损。结论H_2O_2可诱使WB细胞膜理化特性发生改变，脂质过氧化产生及造成基因组DNA损伤，此可能与H_2O_2的致、促癌作用有关。

人乳头瘤病毒16型转换基因的序列分析

为了解中国地区宫颈癌病人中人乳头瘤病毒16 型E6E7 基因结构特点，从中国山东地区宫颈癌活检组织中提取组织DNA，经HPV 多重引物PCR 法鉴定标本中感染HPV 型别，选单纯感染HPV16 型两例标本DNA为模板进行PCR 扩增，获得HPV16 E6E7 基因后，重组入pALTER-1 载体，进行双向测序、分析。DNA 序列分析表明:两例标本的HPV16 E6E7 序列全长均为776bp， 与已发表的德国标准株长度相等，两例均为变异株，共检出5 处核苷酸变异位点，其中4 处可导致氨基酸改变。中国山东地区宫颈癌病人中HPV16 E6E7 的基因结构与德国标准株的HPV16 E6E7 基因之间存在差异。

人乳头瘤病毒16型修饰后E6E7基因免疫原性增强

利用突变修饰后消除转化活性并保留抗原性的中国山东地方株人乳头瘤病毒 16型 (humanpapillomavirustype16 ,HPV16 )E6E7融合基因 (fmE6E7) ,研制治疗HPV16相关疾病的DNA疫苗。用PCR扩增fmE6E7基因后 ,插入真核表达质粒获得pVR10 12 fmE6E7,瞬时转染Cos 7细胞 ,免疫荧光法检测证实其表达后 ,在C5 7BL 6小鼠后腿肌肉进行裸DNA免疫 ,5 1Cr释放法体外分析免疫鼠的细胞毒性T淋巴细胞活性 (cytotoxicTlymphocyte,CTL) ,间接ELISA法检测免疫鼠血清中E7特异性抗体。研究表明修饰后的中国地方株E6E7融合基因可诱导机体产生特异的抗体反应和CTL反应 ,与单独野生型E7基因免疫相比 ,E6E7融和基因可更好的活化CTL反应。表明修饰后消除转化活性的中国地方株E6E7融合基因可作为HPV16治疗性DNA疫苗的靶基因。

人乳头瘤病毒16型E7C端亚基因片段的克隆与表达

目的旨在获得无转化活性而保留抗原性的人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）Ｅ７Ｃ端，为进一步研制抗ＨＰＶ１６疫苗打下基础。方法应用自行设计合成的引物进行ＰＣＲ扩增ＨＰＶ１６Ｅ７Ｃ端亚基因片段，并克隆入真核表达载体ｐＬＮＣＸ。结果准确获得含有Ｅ７Ｃ亚基因片段的重组质粒ｐＬＮＣＥ７Ｃ，将ｐＬＮＣＥ７Ｃ转染Ｂ１６细胞。对Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交阳性克隆应用Ｅ７多抗进行免疫组织化学方法检测，检出Ｅ７Ｃ的表达。结论所构建的表达质粒适于ＤＮＡ疫苗的制备。

超氧阴离子自由基致NIH3T3细胞DNA损伤与c-myc基因表达

目的 研究超氧阴离子自由基 (O2 .- )对 NIH3T3细胞 DNA的损伤及其脂质过氧化作用和对 c- m yc基因表达的影响。方法 用黄嘌呤 -黄嘌呤氧化酶 (X- XO)系统产生 O2 .- ;测定 DNA-溴乙锭结合物荧光强度变化确定 DNA损伤程度 ;以硫代巴比妥酸法测定脂质过氧化产物丙二醛 (MDA)含量 ;以细胞原位杂交法检测 c- myc基因表达。结果 高剂量 O2 .-能直接引起 DNA断裂损伤。O2 .-作用于完整细胞 ,MDA含量及 DNA断裂损伤显著增加 ,过氧化氢酶能明显抑制此效应。中、高剂量 O2 .- 能引起明显的 c- myc基因表达。结论 O2 .- 引起细胞 DNA损伤与过氧化氢的形成有关 ,其损伤的途径可能是通过膜脂质过氧化 ;O2 .- 诱导 NIH3T3细胞 c- m yc基因表达与剂量密切相关。