共表达胞嘧啶脱氨酶和胸苷激酶双自杀基因杀伤大鼠血管平滑肌细胞的机制研究

目的 :研究共表达胞嘧啶脱氨酶 (CD)和胸苷激酶 (TK)双自杀基因对大鼠血管平滑肌细胞的杀伤机制。方法 :将表达CD和 (或 )TK的单、双自杀基因重组腺病毒载体分为 4组即Ad EF1α CD组、Ad CMV TK组、Ad EF1α CD CMV TK组和Ad lacZ组。感染原代培养的大鼠主动脉血管平滑肌细胞 ,感染复数为 2 0。给予相应的前体药物 5 氟胞嘧啶和脱氧鸟苷后 ,用四甲基偶氮挫盐微量酶反应比色法 (MTT)和流式细胞术分析细胞死亡率。荧光染料Hoechst 3 3 3 42核染色观察凋亡细胞。琼脂糖凝胶电泳检测凋亡细胞基因组脱氧核糖核酸 (DNA)的降解。结果 :血管平滑肌细胞可被重组腺病毒有效感染 ( 70 % )。MTT检测发现Ad EF1α CD CMV TK组双自杀基因及其前体药物 [5 氟胞嘧啶 ( 3 0 μg/ml)和脱氧鸟苷 ( 0 3 μg/ml) ]的细胞毒效应可达 91% ,高于Ad CMV TK组 ( 68% )和Ad EF1α CD组 ( 63 % )单自杀基因组。流式细胞仪分析Ad CMV TK组和Ad EF1α CD CMV TK组的杀伤作用是以细胞毒性坏死和凋亡为主。凋亡细胞荧光染色显示Ad EF1α CD CMV TK组和Ad CMV TK组细胞的凋亡率分别为 11 0 %和 12 0 % ,高于Ad CMV LacZ组 ( 1 2 % )和Ad EF1α CD组 ( 5 0 % )。琼脂糖凝胶电泳发现在Ad CMV TK组和Ad EF1α CD CMV TK组的基因组DNA可?

蛋白涂层支架携带一氧化氮合酶基因转染小型猪冠状动脉的可行性研究

目的 :探索蛋白涂层支架携带质粒介导人肝脏诱导型一氧化氮合酶 (i NOS)基因转染小型猪冠状动脉可行性。 方法 :使用蛋白支架吸附去内毒素纯化质粒 ,以常规支架置入技术置入小型猪冠状动脉前降支中段。置入后第 7天取出前降支置入段 ,分别提取总核糖核酸 (RAN)并进行逆向多聚酶链反应 (RT- PCR) ,免疫组化染色检测导入人肝脏i NOS蛋白的表达。 结果 :小型猪前降支置入支架处显示人 i NOS基因信使核糖核酸 (m RNA)转录 ,免疫组化染色显示中膜、内膜人i NOS基因表达人 i NOS蛋白的颗粒 ,以平滑肌细胞最明显。 结论 :蛋白涂层支架吸附去内毒素携带人 i NOS基因质粒植入小型猪前降支冠状动脉 ,RT- PCR显示人 i NOS基因的 m RNA转录 ,免疫组化显示人 i NOS蛋白的表达。

8～10周龄胎儿心脏cDNA文库大规模表达序列标签分析

目的 :研究心脏发育过程中基因表达特点。 方法 :随机选择 8～ 10周龄胎儿心脏互补脱氧核糖核酸 (c DNA)文库的克隆进行表达序列标签 (EST)测序 ,结果与基因库 /欧洲分子生物学实验室 /日本脱氧核糖核酸数据库 (Gen Bank/ EMBL/ DDBJ)进行同源性比较 ,所获 EST进行功能分类 ,并比较其与 10～ 12周龄胎儿及成人心脏表达基因功能分类的不同。 结果 :2 338条 EST中 ,16 14条 6 9.0 3%与已知基因匹配 ,5 47条 (2 3.4% )与其它 EST或基因组 DNA相似 ,177条(7.5 7% )是新 EST。发现了不同心脏发育时期中基因表达的特点。 结论 :大规模 EST分析是系统研究心血管系统不同发育时期基因表达特点的有力工具。

携带反义凝血酶受体和p21双基因共表达腺病毒伴随病毒载体的构建与包装

为探讨双基因共表达对再狭窄的防治作用 ,分别构建了含反义凝血酶受体 (ATR)或 /和 p2 1单、双基因及报告基因绿色荧光蛋白 (GFP)的腺病毒伴随病毒 (AAV)载体 .上述载体经脂质体介导转染BHK 2 1细胞 ,G4 18筛选获得整合有外源基因的细胞株 .克隆形成过程中显示单、双基因转染后细胞增殖受到了不同程度的抑制 ,克隆形成速度减慢 ,细胞形态改变 ,且双基因的作用明显大于单基因 .以绿色荧光出现说明报告基因得到表达后 ,又以DNA印迹证实ATR和p2 1单、双基因已整合于细胞基因组中 ,并维持了凝血酶受体 (TR)基因的反义位置 .半定量RT PCR证实TR基因表达降低 ,p2 1基因表达升高 ,ATR和p2 1(AP)双基因得到了共表达 .以具有可提供复制和包装功能的重组单纯疱疹病毒rHSV rc/ΔU12分别感染载有不同基因的BHK细胞株 ,包装产生重组AAV (rAAV)病毒 ,并经点杂交法测定其滴度 (每毫升病毒液中所含病毒颗粒数 ) .rAAV/AP中ATR与 p2 1的病毒颗粒数分别为 1 0 2× 10 13 /ml和 1 0 8× 10 13 /ml,单基因rAAV/ATR的滴度为 6 5 4× 10 12 /ml,rAAV/P2 1为 1 0 6× 10 13 /ml,为进一步的体内外实验奠定了物质基础 .

反义凝血酶受体和p21双基因共表达对损伤的大鼠颈总动脉的影响

目的 :观察反义凝血酶受体 (ATR)和 p2 1双基因治疗对WKY大鼠颈总动脉损伤后新生内膜的抑制效果 ,探寻基因治疗再狭窄的有效途径。 方法 :将 42只雄性WKY大鼠随机分成基因治疗组 (导入rAAV/AP组 ,n =18)、载体对照组 (导入rAAV/GFP组 ,n =18)和正常对照组 (n =6 )。构建含有ATR和 p2 1双基因及含有绿色荧光蛋白 (GFP)基因的腺病毒伴随病毒(AAV)载体pSNAV/AP和 pSNAV/GFP ,用重组单纯疱疹病毒 (rHSV )生产体系包装重组腺病毒伴随病毒 (rAAV ) :rAAV/AP和rAAV/GFP。将rAAV/AP或rAAV /GFP导入拉伤的WKY大鼠的颈总动脉。分别于术后 2、 4、 6周取材 ,用半定量—逆转录多聚酶链反应和免疫组织化学方法检测凝血酶受体 (TR)和 p2 1在动脉壁中的表达。图像分析和统计学检验双基因的疗效。 结果 :逆转录多聚酶链反应和免疫组织化学结果显示外源基因已导入血管壁的新生内膜和中膜并获得稳定表达。图像和统计学分析说明 :基因治疗后 2、 4和 6周 ,双基因治疗组 ( p2 1和ATR)的颈总动脉内膜厚度分别较载体对照组组内膜减少 5 9 2 %、 5 8 7%、 6 4 1%;中膜厚度分别减低 7 8%、 10 8%、 8 3%;中膜细胞密度减低 30 0 %、2 9 4 %、 2 6 2 %。 结论 :ATR和p2

人凝血酶反应素-1的结构与功能

人凝血酶反应素 (TSP) - 1属糖蛋白 ,广泛分布在血液及心、肺、肾等组织中 ,受血清及多种生长因子的调节 ,具有抗凝血、抗血管生成等作用 ,近来有研究表明 ,它可明显抑制血管平滑肌细胞的增殖 ,可能与再狭窄发生机制有关。本文就人 TSP的结构、组织分布、表达调控和功能研究予以介绍。

风湿性心脏病心力衰竭患者抗心脏β_1和M_2受体自身抗体的研究

目的：探讨抗心脏Ｇ－蛋白偶联型β１ 和Ｍ２ 受体的自身抗体是否与风湿性心脏病（ＲＶＨＤ）心力衰竭有关。方法：以心脏Ｇ－蛋白偶联受体β１ 和Ｍ２ 细胞外第二环表位肽段序列的合成肽作为抗原，应用酶联免疫吸附测定（ＥＬＩＳＡ）技术检测５０ 例ＲＶＨＤ患者和４１ 例正常人血清中抗心脏β１ 和Ｍ２ 受体的自身抗体。结果：５０ 例ＲＶＨＤ心力衰竭患者中有２０ 例存在抗心脏β１ 受体自身抗体（４０．０％ ），正常组仅５ 例（１２．２％ ）；前组又有２４ 例存在抗心脏Ｍ２ 受体自身抗体（４８．０％ ），正常组仅４ 例（９．８％ ）。ＲＶＨＤ组β１ 和Ｍ２ 自身抗体的滴度分别为１∶１０４ 与１∶１１７，正常组为１∶４０ 与１∶２４（Ｐ＜ ０．０５）；心功能Ⅱ～Ⅲ级的阳性率及抗体滴度也明显高于心功能Ⅳ级。结论：抗心脏β１ 和Ｍ２ 受体的自身抗体与ＲＶＨＤ有关，这两种自身抗体可能参与ＲＶＨＤ心力衰竭的病理改变。