抗肿瘤的PF4及相关肽基因重组腺病毒的构建

利用细菌内同源重组法构建含PF4(血小板第四因子)全长1-70及PF4的小肽17-70基因的重组腺病毒。方法:将连有MCP-1信号肽的PF4全长及其C末端的改构体PF4-17-70两个基因片段克隆至腺病毒穿梭质粒pAdshuttle-CMV中,形成转移质粒pAdshuttle/PF4(1-70)和pAdshuttle/PF4(17-70),将之酶切线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183,抽提并鉴定含目的基因的重组体质粒,而后用磷酸钙共沉淀方法转染HEK293细胞,包装成重组腺病毒AdPF4(1-70)和AdPF4(17-70)。采用PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定,扩增并纯化病毒,用TCID50方法测病毒滴度,利用带有CMV-LacZ的对照重组腺病毒(Ad-LacZ)对感染效率进行监测。结果:利用电穿孔法分别将质粒pAdshuttle/PF4(1-70),pAdshuttle/PF4(17-70)与质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183获得70%以上的阳性重组体细菌克隆。PCR检测结果表明重组腺病毒已含有目的基因,滴度为1×1010pfu/ml。结论:利用细菌内同源重组法可以简便、快捷地构建含PF4(1-70)、PF4(17-70)cDNA的腺病毒载体,为两者在肿瘤基因治疗中的应用奠定了基础。

腺病毒载体介导的血小板第4因子p17-70 cDNA对荷瘤裸鼠抗血管新生的作用

目的 以腺病毒做载体研究血小板第 4因子 (PF4)氨基末端改构体cDNA(p1 7 70cDNA)的荷瘤裸鼠体内、外抗血管新生作用。方法 将p1 7 70cDNA克隆至AdEasyTM系统 ,转染 2 93细胞包装成含p1 7 70cDNA的腺病毒载体。用RT PCR方法证明有p1 7 70cDNA外源基因插入 ,Western印迹分析KB细胞 (人上皮细胞癌 )表达的目的蛋白P1 7 70肽。用此病毒直接转导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)并将此病毒注射到负有KB细胞的荷瘤裸鼠体内。以内皮细胞的增殖情况及瘤块体积、质量、瘤体内微血管数分析P1 7 70肽的抑制血管新生的作用。结果 转导p1 7 70cDNA病毒后的HUVEC增殖较含空载体病毒对照减低 58% ,注射病毒 2周后的实验组、空载体组及PBS对照组瘤块质量分别为 (0 0 86± 0 .0 54)g ,(0 .1 71± 0 .0 76)g和 (0 .1 95± 0 .0 67)g ,体积分别为 (1 6 .7± 5 .2 )mm3 、(36 .5± 2 3 .7)mm3 和 (41 .5± 1 2 .2 )mm3 ,免疫组化示微血管计数分别为 9.5± 1 .2 ,30 .6± 2 .6 ,31 .3± 2 .5 ,实验组、空载体病毒组及PBS对照组之间差异有显著性 (P <0 0 5) ,而空载体病毒与PBS两个对照组之间差异无显著性 (P >0 .0 5)。结论 腺病毒载体介导的P1 7 70肽体外具有抑制内皮细胞增殖活性 ,裸鼠体内具有抑制血管新生从而抑制肿瘤生长?