干细胞移植治疗心血管系统疾病在体示踪影像学研究进展

干细胞移植治疗心血管疾病在动物实验和临床实验中均有很大的进展,采用有效的无创伤性技术监测和追踪干细胞移植治疗的效果,并对移植体内的细胞分布、迁移进行动态的在体观察,对干细胞移植在动物实验研究和临床应用方面起到了促进作用。近年来,用来示踪心血管系统疾病中干细胞移植的各种显像技术和造影剂也有了长足的发展。现对光学成像、放射性核素标记干细胞显像及铁纳米颗粒标记干细胞显像等在体示踪技术进行综述。

经冠状动脉内移植骨髓间充质干细胞在体示踪及体内再分布的实验研究

目的探讨利用心脏磁共振成像(MRI)对经冠状动脉内注射的超顺磁性氧化铁颗粒(SPIO)标记的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)进行在体示踪的可行性,观察移植细胞在体内的再分布情况。方法从猪的髂骨处抽取骨髓,分离、培养BMMSCs。用SPIO和CM-DiI(Cell TrackerTMC-7001,Molecular Probe)对细胞进行双重标记。通过导管将标记的细胞注射到冠状动脉左前降支内,分别在细胞移植后当天、移植后1周、3周通过MRI检查对移植细胞进行在体示踪;并分别取不同器官的组织标本进行组织病理学检查。结果冠状动脉内注射的SPIO标记的BMMSCs可在心脏MRI上显影,表现为散在分布的点状信号缺失或低密度影像,并可持续3周。病理检查发现移植细胞较为均匀的分布在移植冠状动脉相关的心肌组织内,在移植后1周可见细胞进入冠状静脉系统内。移植细胞在体内能分布至肺、脾和肾,而在肝组织中很少见。结论用MRI技术可对经冠状动脉内注射的SPIO标记的BMMSCs进行在体示踪;移植细胞在体内有向非靶器官再分布的情况,相关器官组织形态学未见明显的改变。

雪旺细胞促进骨髓间充质干细胞增殖的实验研究

目的通过雪旺细胞(Schwann cell,SC)与骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)复合培养,观察SC对MSCs增殖的影响,为其在构建组织工程血管中应用提供实验依据。方法选用体重40gSD大鼠,用组织块培养法获取SC,用骨髓差速贴壁法获取MSCs;用免疫组织化学法分别对两种细胞进行鉴定。用Transwell培养板复合培养两种细胞,实验组于板上层接种MSCs,下层接种SC;同时上下两层均接种MSCs设为对照组。各组均选择第1、3、5和7天4个时间点进行检测,用氚标胸腺嘧啶核苷酸标记MSCs,液体闪烁仪进行细胞计数(counts per minute,CPM)。提取实验组SC、MSCs和对照组MSCs的细胞蛋白,分别对血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和其受体Flk-1,协同受体1(neuropilin-1,NRP-1)进行Westernblot检测。结果SC呈梭形,表达S-100蛋白,阳性率达90%。MSCs表达CD105和CD44,不表达CD34和CD45。Transwell复合培养:MSCs,第1、3、5和7天增殖数量分别为2411.00±270.84、3016.17±241.57、6570.83±2848.27、6375.83±1431.28,明显大于对照组2142.17±531.63、2603.33±389.64、2707.50±528.55、2389.00±908.01,差异有统计学意义(P<0.05),实验组CPM值于第5天最高。于复合培养第5天Westernblot显示:SC表达VEGF、Flk-1和NRP-1;VEGF、Flk-1、NRP-1在实验组MSCs中表达明显强于对照组。结论两种细胞体外复合培养后,SC在第1、3、5和7天均能显著增加MSCs的数量,并促进增殖,增殖高峰在第5天。与SC复合培养后,MSCs表达VEGF明显增加,其相应受体Flk-1、NRP-1表达上调,SC通过促进MSCs分泌VEGF增加参与了细胞的增殖过程。

阳离子脂法介导质粒转染大鼠骨髓基质干细胞用于基因修饰的细胞移植治疗

目的探讨阳离子脂转染方法在骨髓基质干细胞(BMSC)基因转染中的应用。方法通过梯度试验确定相对最佳的转染条件并测定LipofectamineTM2000(LP2000)介导增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染大鼠BMSC的瞬时转染效率;分析细胞周期对导入基因表达的影响;以流式细胞仪测定转基因BMSC的EGFP表达强度和阳性比例随时间的变化;将EGFP基因转染的大鼠BMSC注射法移植入同源大鼠心肌内,以逆转录PCR法检测心肌组织内EGFP基因的转录,荧光显微镜法检测EGFP阳性的BMSC。结果在不同转染条件下(DNA浓度、DNA:LP2000),LP2000介导EGFP基因转染大鼠BMSC的瞬时转染效率不同;通过阳离子脂法导入基因的表达效果受细胞周期制约;细胞移植后,能在大鼠心肌组织中检测到EGFP基因的转录以及表达EGFP基因的BMSC。结论阳离子脂可以作为基因修饰的细胞移植治疗的有效载体。为了提高基因转染的瞬时效率和基因的表达效率,降低毒性、满足转基因细胞移植的要求,尚需进一步的研究。

降低医用牛心包致热原性研究

目的比较不同浓度酒精溶液洗脱医用牛心包中残留戊二醛的效果,通过酒精溶液洗脱作用降低其致热反应。方法牛心包经戊二醛固定后,再用酒精溶液处理,未经酒精溶液处理组作为对照组。分别采用50%、60%、70%、80%、90%酒精溶液对医用牛心包进行浸泡洗脱处理,应用气相色谱法测定洗脱液中戊二醛的浓度,比较不同浓度酒精溶液洗脱戊二醛效果;并采用2005年版《中华人民共和国药典》附录热原检查的方法,检测经60%、70%、90%不同浓度酒精溶液洗脱后牛心包致家兔体温升高的差别。结果洗脱实验中,60%和70%酒精溶液对医用牛心包冲洗后,洗脱液中戊二醛含量分别达18.21‰±0.14‰和11.91‰±0.09‰,优于其余浓度组(n=3,P<0.01),60%酒精溶液组优于70%酒精溶液组(n=3,P<0.05);热原实验,60%、70%、90%酒精溶液处理组、戊二醛对照组家兔体温升高值分别为0.5℃、0.6℃、0.9℃、0.8℃,其中以60%的酒精溶液效果最优,与对照组相比差异有统计学意义(n=3,P<0.05),其余两组与对照组比较差异无统计学意义。结论60%酒精溶液处理可以有效洗脱医用牛心包中残留戊二醛,并且可明显降低其致热原性。

乳鼠心肌细胞联合人工基质移植改善大鼠心肌梗死后心功能的实验研究

目的探讨体外构建液态组织工程学心肌(engineering heart tissue,EHT)的方法,以及其移植于大鼠心肌梗死区域后是否能存活并改善心脏功能。方法结扎雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠左冠状动脉,制作心肌梗死模型。分离、标记及培养新生1～3天SD乳鼠心肌细胞。心肌梗死后合格的动物模型随机分成EHT组(n=12)、单纯心肌细胞组(n=12)、单纯基质组(n=12)、对照组(n=11)。移植术后4周,用超声心动图及离体心脏灌流2种手段评价心功能,标本取材做病理学检查及Y染色体多聚酶链检测(polymerase chain reaction,PCR)。结果PCR检测证实EHT组和单纯细胞组移植细胞存活,但病理学检查表明EHT组的移植细胞排列更紧密,细胞间有连接蛋白形成。超声心动图显示EHT组的左室缩短分数最高(22.82±3.44)%,高于细胞组(20.55±4.11)%、人工基质组(17.05±4.57)%和对照组(19.80±3.98)%,P=0.012。心脏灌流模型提示在左心室球囊容积为0.06、0.08、0.10ml时,左心室发展压及dp/dt差异有统计学意义,EHT组最佳(P<0.05)。结论体外成功构建液态EHT后,可以通过注射方法移植于大鼠心肌梗死区域。液态EHT移植后较单纯细胞移植组织形态更佳、更能改善梗死心脏的功能。