云南省1株柯萨奇病毒A组8型分离株全基因组分析

目的分析柯萨奇病毒A组8型(Coxsackievirus A8,CVA8)云南分离株A8-1/YN/CHN/2019全基因组序列及其遗传特性,以期了解CVA8的流行和变异情况。方法设计针对CVA8的引物,提取病毒RNA,RT-PCR扩增VP1序列并测序,BioEdit 7.2.3拼接得到全基因组,使用MEGA 7.0软件进行系统进化分析,应用Simplot 3.5.1及RDP4软件进行重组分析。结果A8-1/YN/CHN/2019株长7396 nt,编码2188个氨基酸。其VP1与CVA8原型株AF081299/Donovan/USA/1998核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为81.04%和95.24%;A8-1/YN/CHN/2019株属于基因型E,其他中国分离株位于D和E型。重组分析发现A8-1/YN/CHN/2019株在非结构编码区的P2和P3段上发生重组。结论A8-1/YN/CHN/2019株为E基因型,并在P2、P3段的非结构区发生了重组事件。

人类与部分实验动物RETN基因同源性分析

目的分析人类与部分实验动物的RETN基因同源性,为人类RETN基因相关疾病及基因功能研究对理想实验动物的选择提供依据。方法提取猕猴、大鼠、小鼠和树鼩的脂肪组织总RNA,用相应的RETN引物进行RT-PCR,对其产物进行双向测序;同时在GenBank中查询人类、猪、牛的RETN基因序列;再运用ORF Finder软件调取其ORF核苷酸序列和氨基酸序列,用DANMAN软件对所获得的序列进行比对,分析其同源性。结果人类RETN的核苷酸序列与猕猴、小鼠、树鼩、大鼠、猪、牛的同源性分别为95.4%、65.4%、65.4%、66.4%、81.0%、81.0%;氨基酸序列分别为91.7%、55.6%、55.6%、53.7%、75.9%、72.2%。;系统进化树结果表明,就RETN基因而言,人与猕猴的亲缘关系较近。结论基于同源性分析结果,在RETN的进化上猕猴与人类存在较近的亲缘关系,是研究人类RETN生物学功能及其相关疾病的最佳实验动物。

巨噬细胞抗单纯疱疹病毒1型感染作用机制的研究进展

单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus type 1,HSV-1)是一种具有免疫逃逸、潜伏以及再感染能力的DNA病毒。尽管其生物学特性已被广泛研究,但目前尚未开发出专门针对HSV-1的治疗药物和预防性疫苗。HSV-1的感染能够引发宿主固有免疫和适应性免疫响应。其中,巨噬细胞通过病原体的吞噬、加工和提呈等过程,在抗病毒免疫反应中发挥着重要作用。本文对巨噬细胞在对抗HSV-1感染中作用的最新研究进展作一综述,以期为未来的疫苗设计和药物研发提供参考。

一株引起病毒性脑炎的柯萨奇B3病毒的生物学特性分析

目的通过分析分离自病毒性脑炎病人的一株柯萨奇病毒B3株KMA103-09生物学特性,研究其致病机理。方法将KMA103-09病毒分别按一定量接种至KMB17细胞、RD细胞、VERO细胞、Hep-2细胞、Hela细胞及MRC-5细胞进行培养,观察细胞的生长情况,并采用微滴法检测病毒在不同时间、不同细胞中的病毒感染滴度;将一定量KMA103-09病毒注射乳鼠和成鼠脑内,观察病毒的致病性,并检查鼠血清中IL-2、IL-4、IL-6、IFN-r、TNF、IL-17A、IL-10含量。结果该病毒株在6种细胞上皆能适应生长,并产生明显的细胞病变效应。病毒在Hela细胞上生长繁殖最快,42h时细胞全部发生病变,感染性滴度达8.625lgCCID50/ml;在MRC-5细胞上病毒的感染性滴度最低,120h才全部发生病变,感染性滴度为5.50lgCCID50/ml。该病毒对一日龄乳鼠致死并在脑、肺和心脏等组织产生病理改变,实验乳鼠血清IL-6、IL-10、TNF含量分别为4.71pg/ml、21.08pg/ml和36.79pg/ml,与阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),其余4种皆无表达。该病毒对成鼠不致病,脑、肺、心脏病理检查无异常。结论 KMA103-09病毒在Hela细胞生长适应性良好,对乳鼠致病而对成鼠不致病。

高糖高脂灌喂法快速建立2型糖尿病小鼠模型

目的用高糖高脂灌喂法快速建立2型糖尿病小鼠模型。方法将30只小鼠随机分为正常对照组和2型糖尿病组,每组15只,2型糖尿病组小鼠按40mg/kg体重的剂量腹腔注射STZ,连续注射5天停药,同时每天灌喂高糖高脂乳液2ml至4周,然后通过血糖、血脂、葡萄糖耐量试验、胰岛素耐受试验和组织病理检测等进行2型糖尿病特征的综合评价。结果 2型糖尿病组小鼠空腹血糖值达9.94mmol/L,出现高胆固醇、高甘油三酯和高低密度脂蛋白的混合型高脂血症;葡萄糖耐量试验和胰岛素耐受试验结果表明,糖耐量受损并有明显的胰岛素耐受;组织病理分析发现,肝脏、胰腺和肾脏组织出现不同程度的脂肪变性和炎症。结论快速建立了具有人类2型糖尿病临床和组织病理特征的2型糖尿病小鼠模型。

HCV感染树鼩模型中腹部横切手术及肝门静脉注射新方法的建立

目的采用腹部横切手术及肝门静脉注射法将丙型肝炎病毒(hepatitis c virus,HCV)迅速足量注射接种到树鼩体内肝脏,提高HCV对树鼩的感染率。方法采用横切打开树鼩腹腔,找到肝门静脉,进行肝门静脉注射接种HCV,手术后1周进行采血、ALT检测、HCV病毒载量检测、肝脏病理检测及HCV-RNA抗原检测。结果横切手术及肝门静脉注射20只树鼩,手术后经护理恢复,树鼩伤口恢复良好,手术成功率及肝门静脉注射准确率均达100%,保证HCV完全快速进入树鼩肝脏。有60%(12/20)树鼩出现一过性的病毒血症或间歇性病毒血症,感染树鼩的病毒载量最高可达到1x105拷贝/mL,肝功能中ALT指标最高可达到192μ/L,肝脏活体组织病理检查发现不同程度的肝炎症状,肝组织能检测到HCV-RNA抗原。结论腹部横切具有充分暴露肝门静脉、操作方便、符合解剖生理、组织创伤较小、伤口易于愈合等优点,适用于肝门静脉注射,同时提高了感染率,该技术方法为进一步深入研究HCV感染树鼩奠定基础,对于其它相关实验动物和动物实验具有一定借鉴经验和参考价值。

Ⅰ-Ⅳ登革病毒基因同源性分析及Ⅱ型C蛋白二级结构预测

目的对登革病毒(dengue virus,DENV)Ⅰ~Ⅳ基因同源性进行分析,同时对DENVⅡC蛋白的二级结构进行预测,为更深入了解DENV 4个血清型间差异及衣壳蛋白C构想。方法通过DNAMAN分子生物学分析软件和蛋白结构在线预测网站分别对登革病毒基因同源性及C蛋白的二级结构进行预测。结果在登革病毒基因组同源性中,DENVⅠ与Ⅲ同源性最高为72%,发现DENVⅠ与Ⅳ同源性最低为67%;在登革病毒基因中,前膜基因prM的的同源性最高为82.5%,非结构基因NS2a的同源性最低为55.28%。在编码capsid的氨基酸中,占组成比例最多的为是精氨酸,可能存在的蛋白结合位点较多。结论通过基因组同源分析图谱看出Ⅰ~ⅣDENV在结构基因(C、prM、E)之间和非结构基因NS1,NS2b和NS3中的同源性较高,同时蛋白二级结构预测发现DENV ⅡC蛋白可能具有分子识别和蛋白骨架等功能。

血清对Ⅱ型脊髓灰质炎病毒感染性滴度检测结果的影响

目的比较6种不同血清对Ⅱ型脊髓灰质炎病毒感染性滴度(CCID50)检测结果的影响。方法分别采用6种未处理血清和6种预处理血清组(免疫吸附法)进行Ⅱ型脊髓灰质炎病毒感染性滴度检测(微细胞病变法),检测了不同组血清中Ⅱ型脊髓灰质炎病毒中和抗体滴度,并使用处理血清组进行促细胞生长试验。最后分析不同血清对感染性滴度的影响。结果6种未处理血清组病毒感染性滴度检测结果差异有统计学意义(P<0.01),6种处理血清组病毒感染性滴度差异无统计学意义(P>0.05)。未处理组2号血清的中和抗体滴度为1∶4,6号血清的中和抗体滴度为1∶8,其余各组血清的中和抗体滴度均<1∶4。6种处理血清组的中和抗体滴度均为1∶2。血清促细胞生长试验显示6种处理组血清细胞生长趋势正常。结论Ⅱ型脊髓灰质炎病毒感染性滴度检测前使用免疫吸附对血清进行预处理,可降低血清中存在的中和抗体对检测的影响,为比较不同实验室数据提供可能。

封闭群树鼩的微卫星遗传特性分析

目的比较分析远交繁殖的I^IV代次的滇西亚种树鼩群体的遗传差异和分化程度,为培育封闭群树鼩种群提供遗传学依据。方法提取I^IV四个代次共49只滇西亚种树鼩的全血基因组DNA,选取树鼩的18个微卫星位点,结合荧光标记(FAM)PCR扩增技术,通过毛细管电泳技术检测扩增产物,并利用POPGENE、FSTAT等软件比较各代次树鼩的遗传相关指标。结果四个代次的树鼩群体共检测到等位基因(Na)89个,平均有效等位基因数(Ne)为3.779,平均观察杂合度(Ho)为0.523,平均期望杂合度(He)为0.613,平均多态信息含量(PIC)为0.558,平均Shannon信息指数(I)为1.277,平均等位基因丰富度(AR)为2.938,遗传分化系数(Fst)平均值为0.046;其遗传距离及无偏遗传距离分别为0.049~0.159和0.022~0.109。结论培育的树鼩群体的遗传多样性较丰富,且不存在较大的遗传差异和分化程度。

肠道病毒71型灭活疫苗（人二倍体细胞）免疫儿童血清中抗脊髓灰质炎病毒及抗甲肝病毒抗体的动态观察

目的观察适龄健康婴幼儿接种肠道病毒71型灭活疫苗（人二倍体细胞）后血清中抗EV71中和抗体、抗脊髓灰质炎病毒中和抗体及抗甲肝病毒IgG抗体的动态变化。方法收集接种EV71灭活疫苗后受试者的血清进行中和试验检测抗EV71、抗脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型中和抗体滴度：用ELISA方法检测抗甲肝病毒IgG抗体浓度。结果首剂接种EV7l灭活疫苗后引起儿童血清中抗EV71中和抗体平均几何滴度（GMTs）上升至4．85，第2剂免疫28d后GMTs明显上升至64．37。对这些受试儿童血清内抗脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型中和抗体及抗甲肝病毒IgG抗体动态观察发现，0d（EV71疫苗接种前）相比，3个型别的抗脊髓灰质炎病毒中和抗体在28d（第1剂疫苗接种后28d）出现了轻微波动（P〈0．05），在56d（第2剂接种后28d）时I、Ⅲ型抗脊髓灰质炎病毒抗体也有轻微差异，但Ⅱ型已恢复至0d水平（P〉0．05）；抗甲肝病毒IgG抗体水平保持稳定，在观察期间内的波动差异无统计学意义（P〉O．05）。结论EV71灭活疫苗在两剂全程免疫并诱导特异性抗EV71中和抗体的过程中，对儿童体内原先存在的抗甲肝病毒IgG抗体无影响但对3个型别抗脊髓质炎病毒中和抗体有轻微干扰，总体来说抗体变化均不影响免疫应答的临床有效性。

Hippo信号通路在免疫反应中的相关研究进展

Hippo信号通路也称为Salvador/Warts/Hippo(SWH)通路,命名主要源于果蝇中的蛋白激酶Hippo(Hpo)。该通路由一系列保守激酶组成,主要是通过调控细胞的增殖和凋亡来调控器官的大小。近年来,研究Hippo信号通路在免疫系统以及癌症发生中的作用已成为热点,并且已有多项研究报道其可以调控免疫反应,包括先天性免疫系统和适应性免疫系统中各免疫细胞的功能,影响免疫应答的效果。文章总结了近年来Hippo信号通路在各种免疫细胞及一些免疫应答过程中发挥的作用,探讨了Hippo信号通路的治疗前景。

轮状病毒动物感染模型研究进展

建立动物模型对于疾病致病机理、疫苗研制、药物筛选都具有重要意义。疾病动物模型的建立不仅与病原体的特性有关,还涉及到动物的种类。至今,用于轮状病毒感染的动物模型尚且不多,具有敏感性又适用于大多数毒株的,能完全模拟人的致病过程的实验动物还不确定,给轮状病毒疫苗及治疗药物的研发带来了很大的不便。为推进寻求理想的轮状病毒实验动物模型,查阅近几年国内外关于轮状病毒感染动物模型种类、利用轮状病毒感染动物模型进行的相关实验研究进展以及相关的文献报道,并对其进行了总结分析,为将来可能的优化、选择轮状病毒感染动物模型提供理论参考依据。

柯萨奇病毒B组5型TaqMan一步法RT-qPCR检测方法的建立

目的建立柯萨奇病毒B组5型(coxsackievirusB5,CV-B5)特异的TaqMan一步法实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测方法。方法根据CV-B5的VP1序列,设计特异性引物和TaqMan探针。将目的基因插入pMD18^(TM)载体,在DH5α感受态细胞中扩增,大肠杆菌体外转录后获得RNA标准品并建立标准曲线,最后对检测方法的重复性、敏感度和特异性进行评价。结果该方法在10^(3)~10^(11)拷贝/微升的模板范围内具有良好的线性关系(r^(2)>0.99),扩增效率E=100.9%,敏感度达1×10^(3)拷贝/微升,只对CV-B5有特异性扩增曲线,且重复性较好。结论本实验建立的TaqMan一步法RT-qPCR检测方法有较高的敏感度、特异性和重复性,有良好的抗干扰性,可用于CV-B5的临床样本检测和绝对定量分析。

表达SARS-CoV-2 Delta突变株S蛋白受体结合域和N蛋白的重组腺病毒的构建及鉴定

目的构建表达严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARS-CoV-2)Delta突变株S蛋白受体结合域(receptor binding domain,RBD)和N蛋白的重组腺病毒,并进行鉴定。方法将SARSCoV-2 RBD和N基因片段分别克隆至pcDNA3.0BA载体上,构建重组质粒pcDNA3.0BA-RBD-N,PCR扩增RBD-CMVN片段,连接至穿梭载体pShuttle-CMV上,将穿梭质粒pShuttle-RBD-N与pAdeasy-1进行同源重组,获得重组质粒pAdeasy-1-RBD-N,转染HEK293细胞进行重组腺病毒Ad-RBD-N包装,RT-PCR法检测重组腺病毒中RBD和N基因在HEK293细胞中的转录,Western blot和免疫荧光法检测重组腺病毒中RBD和N蛋白的表达。将Ad-RBD-N通过肌肉注射免疫12只雌性BALB/c小鼠,免疫剂量为5×10^(9)copies/只,免疫后14 d经尾静脉采血,ELISA法检测血清抗体效价。结果重组腺病毒RBD和N基因能在HEK293细胞中正常转录,RBD和N蛋白能在MA104细胞中正常表达。免疫重组腺病毒的小鼠可产生针对RBD和N蛋白的特异性IgG抗体。结论成功构建了表达SARS-CoV-2 Delta突变株S蛋白RBD和N蛋白的重组腺病毒,为Delta突变株疫苗的后续研究奠定了基础。

3种ELISA方法与微量细胞中和试验检测SARS-CoV-2抗体滴度的相关性分析

目的分析不同方法检测严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARSCoV-2)疫苗免疫后抗体滴度的相关性,为其特异性抗体检测提供方法学依据。方法采用微量细胞中和试验及3种ELISA方法(分别以S蛋白、N蛋白和灭活全病毒颗粒为抗原)检测SARS-CoV-2灭活疫苗临床试验血清样品的IgG抗体阳转率及中和抗体滴度,并进行微量细胞中和试验与3种ELISA方法的相关性分析。结果中和抗体、S抗体、N抗体和全病毒抗体检测所得抗体阳转率分别为84.3%、91.3%、65.2%和46.6%,抗体几何平均滴度分别为16.6、945.9、72.7和18.8。3种ELISA方法(分别以S蛋白、N蛋白和灭活全病毒颗粒为抗原)与微量细胞中和试验检测结果的相关系数(r)分别为0.494、0.371和0.181。结论检测SARS-CoV-2 S抗体水平能在很大程度上反映以抗体水平升高为特征的体液免疫反应的激活情况。

肠道病毒71型与宿主相互作用

肠道病毒71型（enterovirus71，EV71）是引起手足口病的主要病原体之一。EV71传播广泛，感染后可引发中枢神经系统疾病，并导致重症手足口病，给公共卫生安全带来极大挑战。EV71的致病机制与病毒和宿主间的相互作用关系密切，涉及EV71病毒复制、微RNA等多个环节。此文就近年来这些方面的研究进展做一综述。

2017年深圳地区冬季诺如病毒基因分型与流行病学分析

目的对深圳地区2017年冬季诺如病毒（Norovirus，NoV）流行株基因型、流行病学特点及同源性进行分析和研究。方法通过提取313份粪便样品的核酸后利用NoV特异性引物进行逆转录PCR（RT．PCR），将阳性PCR产物测序。根据样品测序序列及NoV参考株序列，利用软件Mega4．1及ClustMW构建系统发生树。结果NoV阳性样品共26份且均为GⅡ．4型，分别与GⅡ．4（KY407156）、GⅡ．4（KY580757）及GⅡ．4（KX372682）具有较高的同源性。此外，88．46％的NoV样品与本地区历年流行株同源性较低，且46．15％与我国其他地区流行株存在差异。结论2017年冬季深圳地区诺如病毒流行株以GⅡ．4型为主，且其在流行性及同源性上具有自身的特点．在当地公共卫生工作中需加强关注。

ECHO20病毒株KM／EV20／2010的分离鉴定及其VP1基因序列特征分析

目的分离并鉴定2010年云南省昆明市甲型肝炎患儿粪便标本中混存的ECHO20（Echovirus20，ECHO20）KM／EV20／2010病毒株，分析其VP1基因遗传特征。方法采用KMB17细胞对大便标本进行病毒分离；采用微量细胞病变法，经WHO肠道病毒组合血清及单价血清对该分离株进行鉴定；采用RT—PCR法扩增病毒VP1基因并进行序列测定，并运用Mega4．0等软件进行分析处理。结果分离毒株经微量中和试验鉴定为ECH020血清型，编号为KM／EV20／2010；经RT—PCR法扩增获得为867bp的VP1基因，与国内分离株核苷酸和氨基酸的同源性分别为79．5％～91．7％和98．9％～99．6％，与国外分离株的核苷酸和氨基酸同源性分别为80．2％～83．2％和96．4％～99．6％；在进化树上云南分离株与GenBank中登录的中国国内2001年山东分离株01352和1998年法国分离株94CF1666形成一个进化分支。结论KM／EV20／2010分离株为肠道病毒ECH020型病毒，可用KMB17人二倍体胚肺成纤维细胞分离增殖。