腺病毒载体的研究进展及其在轮状病毒疫苗研究中的应用

腺病毒载体是一种非常有效的转基因载体,具有高效率、高滴度、低致病性及不整合入宿主细胞染色体等优点,是目前非常具有应用前景的转基因载体。本文就重组腺病毒载体的研究进展、研究中的问题和解决方法及其在轮状病毒疫苗研究中的应用作一综述。

灭活轮状病毒与灭活肠道病毒71型联合疫苗的免疫效果

目的评价灭活轮状病毒（rotavirus，RV）与灭活肠道病毒71型（enterovirus71，EV71）联合疫苗的免疫效果及两种抗原间的相互作用。方法将灭活RV与EV71按不同抗原含量配比制成联合疫苗免疫ICR小鼠，同时设单价疫苗组，均经小鼠腿部肌肉注射，隔2周免疫1次，共2次，分别于每次免疫后2周，经小鼠尾静脉采血，分离血清，经56。c灭活30rain后，采用血清中和试验检测小鼠血清中抗RV和抗EV71中和抗体效价。结果初次免疫后14d，各组小鼠血清中RV特异性中和抗体阳转率为50％-67％，中和抗体效价为2．2-2．8，加强免疫后14d，抗体阳转率达100％，中和抗体效价为28．5-35．9。初次免疫后14d，各组小鼠血清中抗EV71中和抗体阳转率为83％-100％，中和抗体效价为4．0-7．1，加强免疫后14d，中和抗体阳转率达100％，中和抗体效价为25．4-71．8；联合疫苗组与单价疫苗组间抗RV及抗EV71中和抗体效价差异无统计学意义（P〉0．05）；Rv和EV71抗原量按160／160EU配比时，可诱导出最高的抗RV抗体及抗EV71抗体应答。结论Rv与EV71联合疫苗可诱导小鼠产生针对两种病毒的体液免疫应答，抗体应答水平与疫苗抗原配比剂量相关，未发现两种抗原间有协同或拈抗作用。

两株灭活轮状病毒疫苗的免疫效果

目的研究轮状病毒(Rotavirus,RV)P[8]G1和P[2]G3株灭活疫苗的免疫原性及不同血清型间的交叉识别作用。方法采用Vero细胞转瓶培养RV,经纯化灭活、佐剂吸附等工艺,制备RV P[8]G1和P[2]G3株灭活疫苗,分别经肌内免疫Wistar大鼠和猕猴,采用ELISA法和微量病毒中和试验检测大鼠和猕猴血清中RV特异性抗体效价和中和抗体效价,流式细胞术检测猕猴血液中CD4+和CD8+T细胞的数量。结果 P[8]G1和P[2]G3株疫苗样品的RV抗原含量分别为10 240和5 120 EU/ml;免疫2次后,P[8]G1和P[2]G3株疫苗诱导大鼠产生的血清IgG抗体GMT分别为(43 407.71±1 654.51)和(41 520.61±2 047.61),诱导猕猴产生的血清IgG抗体GMT分别为(13 654.45±3 125.27)和(10 350.68±997.83);单一血清型疫苗免疫后产生的中和抗体具有型间交叉识别作用;2株疫苗免疫猕猴后均能刺激其CD4+T淋巴细胞增殖,CD8+T淋巴细胞无明显变化。结论 2株RV灭活疫苗均具有良好的免疫原性及型间交叉识别作用。

灭活轮状病毒疫苗与灭活脊髓灰质炎病毒疫苗联合使用免疫效果评价

目的评价灭活轮状病毒疫苗(inactivated rotavirus vaccine,IRV)与灭活脊髓灰质炎病毒疫苗(inactivated poliovirus vaccine,IPV)免疫大鼠后,两种疫苗间免疫效果的相互作用。方法将Wistar大鼠随机分成联合免疫组、间隔免疫组和单疫苗免疫组:联合免疫组接种IPV后4周,经双侧腿同时免疫IPV和IRV,共2次,间隔4周;单疫苗免疫组2组,分别免疫3针IPV和2针IRV,每针均间隔4周;间隔免疫组免疫1针IPV后4周,开始进行IPV和IRV间隔免疫(每针间隔2周,共6周)。分别于每次免疫后4周经尾静脉采血,分离血清,采用微量中和试验结合免疫荧光抑制方法检测血清抗RV中和抗体水平,ELISA法检测血清抗RV特异性Ig G抗体水平,微量中和试验法检测血清抗脊髓灰质炎病毒中和抗体水平。结果大鼠经2针IRV免疫后,血清抗RV中和抗体和特异性Ig G抗体几何平均滴度(geometric mean titer,GMT)均明显上升,血清抗体阳转率均达100%;经3针IPV免疫后,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒中和抗体GMT均明显上升,抗体阳转率均达100%;联合免疫组、间隔免疫组和单疫苗免疫组间血清抗RV中和抗体水平、特异性Ig G抗体水平及抗脊髓灰质炎病毒中和抗体水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论 IRV和IPV免疫大鼠后均获得到良好的免疫效果,两种疫苗联合使用时,免疫效果无相互干扰作用。

轮状病毒规模化纯化方法的建立

目的建立一种可规模化纯化轮状病毒(Rotavirus,RV)的方法。方法以氯化铯密度梯度离心法(离心法)纯化RV作为对照,分析采用离心-微滤-超滤-层析法(模块法)纯化RV的可行性。透射电镜观察病毒形态;微量滴定法测定病毒的感染性滴度;Bradford法检测纯化前后病毒液的蛋白含量,计算蛋白回收率;以两种方法纯化的病毒免疫BALB/c小鼠,微量中和试验检测小鼠血清中和抗体滴度。结果模块法纯化的RV结构完整,感染性滴度可达(7.15±0.10)lgCCID50,可清除超过95%的蛋白质,蛋白回收率为(2.58±0.06)%,免疫小鼠可诱导中和抗体。模块法纯化的RV蛋白回收率、感染性滴度及诱导的小鼠中和抗体水平均显著高于离心法(P<0.05或P<0.01)。结论模块法可有效纯化RV,为RV灭活疫苗规模化纯化工艺的开发提供了实验依据。