肠道病毒71型的生物学特征及研究进展

近年来，肠道病毒71型（enterovirus71，EV71）的流行在亚太地区呈逐渐上升趋势。EV71导致的手足口病已引起社会各界广泛关注，并成为医学预防和基础科研的挑战。此文就EV71的生物学特性、流行病学、致病机制、临床和实验室诊断、预防及治疗等方面的研究进展作一综述。

抗菌肽Cecropin D在毕赤酵母中的表达、纯化及活性鉴定

目的在毕赤酵母GS115中表达抗菌肽Cecropin D,并检测其抗菌活性。方法根据毕赤酵母密码子的偏爱性,人工合成6条寡聚核苷酸片段,经磷酸化、退火、连接并克隆入酵母表达载体pPIC9K。重组表达质粒pPIC9K-D转化至毕赤酵母菌GS115,经G418筛选,阳性高拷贝克隆用0.5%的甲醇诱导表达,表达产物经CM-Sepharose层析柱纯化,Tricine-SDS-PAGE分析,琼脂糖扩散法和比浊法测定其抗菌活性。结果经Tricine-SDS-PAGE检测,在相对分子质量3900左右处可见目的蛋白表达条带,纯化后的目的蛋白纯度达90%以上,获得的抗菌肽Cecropin D对一些革兰阳性菌和革兰阴性菌均有抑菌活性。结论抗菌肽Cecropin D成功地在毕赤酵母中分泌表达,为以后深入研究抗菌肽奠定了基础。

轮状病毒P[2]G3株在Vero细胞上的传代适应性

目的研究轮状病毒P[2]G3株在Vero细胞上的传代适应性,以确定其在Vero细胞上培养的最适条件。方法将P[2]G3株轮状病毒分别以0.01、0.05和0.1MOI接种于Vero细胞,观察细胞病变(CPE)情况,并检测病毒的感染性滴度,确定在Vero细胞上接种病毒的最适MOI。同时观察连续传15代后,各代次病毒的滴度及其基因核酸带型的变化。结果MOI为0.05时,接种病毒后出现CPE及收获时间均较早,病毒的感染性滴度最高,确定接种病毒的最适MOI为0.05。连续传15代,病毒滴度随传代次数的增加而上升,各代次病毒的基因组核酸带型基本一致,且与原代病毒相符。结论轮状病毒P[2]G3株经适应性培养后,可在Vero细胞上稳定传代15代。

轮状病毒P[2]G3株在人二倍体细胞KMB17上的适应性

目的探讨轮状病毒P[2]G3株在人二倍体细胞KMB17上的适应性。方法轮状病毒P[2]G3株在猴肾细胞MA104上经蚀斑筛选纯化后,得到的克隆以不同MOI接种至人二倍体细胞KMB17上。用微量滴定法与蚀斑法平行检测病毒滴度,用免疫荧光法检测病毒的增殖情况,最后进行病毒基因组稳定性检测。结果经MA104细胞培养的轮状病毒P[2]G3株在人二倍体细胞KMB17上可产生明显的细胞病变(CPE),但病变出现的时间随病毒传代次数的增加而延迟,抗原性也逐渐减弱。通过蚀斑筛选纯化得到的克隆病毒,可在KMB17细胞上稳定地增殖。以0.05MOI病毒量接种可产生稳定的CPE,时间为72～96h。连续传代至第10代,病毒滴度达105.5PFU/ml,病毒基因组稳定。结论轮状病毒P[2]G3株在人二倍体细胞KMB17上表现出毒力及增殖能力的衰退;经蚀斑筛选纯化可获得毒力较强的病毒株,并在KMB17细胞中稳定复制、增殖。

RNA干扰技术抗病毒感染的研究进展

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是序列特异的双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）使细胞内同源性mRNA降解，产生特异的基因沉默的过程。其发生在基因转录后，在mRNA水平上进行调控，所以又称转录后基因沉默（posttranscriptional gene silencing，PTGS）。1998年，Fire等在秀丽线虫实验中发现了由dsRNA引起的序列特异性基因沉寂现象，并将此现象称为RNAi。

MiR-125b-1-3p在轮状病毒复制中的作用研究

目的研究miR-125b-1-3p在轮状病毒(rotavirus)复制过程中的作用和调控机制。方法将MA104细胞中的miR-125b-1-3p分别上调和下调后感染轮状病毒,通过RT-PCR分析miR-125b-1-3p的表达情况和轮状病毒拷贝数;免疫荧光分析miR-125b-1-3p对轮状病毒蛋白表达情况的影响;Western blot分析miR-125b-1-3p参与调控的相关蛋白表达情况。结果轮状病毒感染细胞后,miR-125b-1-3p的表达水平明显上调,上调miR-125b-1-3p后,轮状病毒的VP7、NSP3基因拷贝数下降,下调miR-125b-1-3p后,轮状病毒的VP7、NSP3基因拷贝数明显升高;上调miR-125b-1-3p的表达水平后轮状病毒蛋白荧光数下降,下调miR-125b-1-3p后,病毒蛋白荧光数增加;轮状病毒感染细胞16 h后PI3K/Akt通路活性受到抑制,上调miR-125b-1-3p能够抑制PI3K/Akt通路的活化。结论miR-125b-1-3p通过调控PI3K/Akt通路抑制轮状病毒的复制。研究结果为探讨miR-125b-1-3p和PI3K/Akt通路之间的具体调控机制研究提供了实验基础,为轮状病毒抗感染治疗提供了靶点。

血管紧张素Ⅱ基因重组杆状病毒的构建

目的构建携带血管紧张素I(IAngiotensin Ⅱ,AngⅡ)基因的重组杆状病毒,并利用Bac-to-Bac重组杆状病毒表达系统进行表达。方法将重组杆粒bacmid-P1-2A-4AngⅡs-3ABC(rB/HAngⅡ)转染昆虫细胞sf9,包装出重组杆状病毒rBac-P1-2A-4AngⅡs-3ABC(rBAV),通过光学显微镜和透射电镜观察细胞病变(CPE)及病毒形态,采用蚀斑试验检测病毒滴度,PCR及间接免疫荧光技术验证该病毒及感染细胞中AngⅡ和HAV蛋白的表达。结果重组杆粒rB/HAngⅡ转染sf9细胞96 h后,出现典型的CPE;透射电镜下观察可见典型的杆状病毒颗粒;PCR可特异性的扩增出约3 000和1 000 bp的P1-2A-4AngⅡs和3ABC基因片段;P3代重组杆状病毒滴度约为4×108pfu/ml;感染后的sf9细胞中可见特异性的绿色荧光(AngⅡ蛋白)和红色荧光(HAV结构蛋白)。结论已成功构建了携带AngⅡ基因的重组杆状病毒,并在sf9细胞中获得表达,为研制抗高血压疫苗提供了新的思路。

甲/戊型肝炎病毒重组抗原基因的克隆及表达

将甲肝病毒vp1编码基因（aa 24-171）和戊型肝炎病毒ORF2基因（aa 431-615）通过一段编码柔性甘氨酸链（Gly4 Ser Gly4）的基因片断连接,获得编码HAV/HEV融合蛋白基因（AEAg342）.将该融合基因插入质粒pBV220,构建表达质粒pBV220-AEAg342.将pBV220-AEAg342转化入大肠杆菌BL21中进行表达,表达量约占菌体总量的20%,经离子交换层析纯化,目的蛋白纯度达90%以上.Western blot证实该蛋白能与甲肝及戊肝患者阳性血清发生特异性反映,为进一步开发双价疫苗和联合诊断试剂奠定了一定基础.