新型siRNA抗流感病毒活性的研究

目的设计合成具有广谱性抗流感病毒活性的siRNA,分别在细胞内和小鼠体内进行活性评价。方法从甲型流感病毒毒株A/WSN/33的基因(PB2、PB1、PA、M、NS)中提取高度保守的序列设计合成siRNA。通过293T-Gluc系统和单轮感染流感病毒系统对siRNA进行活性筛选。然后在细胞水平检测siRNA对流感病毒复制的抑制作用,并且经雾化给药途径对siRNA的体内抗流感活性进行评价。结果活性筛选得到4条具有50%以上抑制活性的siRNA(siPB2-1、siPB2-2、siPB1-2和siNS-1),EC50值在0.4~1.3 nmol/L之间。4条siRNA对另外两株A/PR/8/34和B/Beijinghaidian/1386/2013(Victoria系)流感病毒均表现出较好的抑制活性。动物实验表明,siPB2-1经雾化给药途径可以对流感病毒感染的小鼠产生一定的保护作用。结论新合成的siRNA在细胞水平和小鼠体内均具有良好的抗流感病毒活性。

抗丙型肝炎药物研究进展——药物、靶点和耐药性

丙型肝炎为丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）引起的全球性传染病。目前全球感染率约为3%，感染者约2亿人[1]。我国在2010年公布了一般人群的血清抗 HCV阳性率为0.43%。丙型肝炎以输血为主要传播途径。15%~40%的感染者6个月内感染症状可自行消失[2-3]，剩余60%~85%发展为慢性丙型肝炎[4]，其中约20%的慢性丙型肝炎患者在慢性感染 HCV 后20年左右的时间内发展为肝硬化甚至肝脏衰竭或 HCV 相关的肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）[5]。目前丙型肝炎的预防尚无疫苗可用。早期最有效的丙型肝炎标准治疗方案是聚乙二醇（PEG）化干扰素α（PEG-IFN-α）与利巴韦林（ribavirin， RBV）联合应用24~48周，但只有40%~50%的基因型为1型患者和约80%的基因型为2或3型患者得到有效治愈[6-8]。2011年，新的标准三联疗法获美国 FDA 认证，该疗法在传统抗丙型肝炎标准方案（PEG-IFN-α和利巴韦林联合用药）基础上加入了两种新批准的蛋白酶抑制剂中的一种，使得对 HCV 基因1型感染治愈率提高到约70%[9-10]，但是其副反应、抗药性以及药物间相互作用等问题依然严重[11]。

Schlafen家族蛋白在肿瘤和病毒感染中的研究进展

Schlafen(SLFN)家族基因是在人类与小鼠中首先被发现的具有调控细胞生长及T细胞分化等诸多生物学功能的重要基因。该家族基因在小鼠、马和人等各个物种中广泛存在并具有较高的同源性。研究表明,SLFN蛋白在抑制细胞增殖、驱动减数分裂、调控造血细胞、下调血小板数量及调节免疫应答等方面均起到重要的作用,同时还可抑制HIV-1和流感等病毒复制。此外,SLFN蛋白还被发现与肿瘤的治疗密切相关,可以作为预测肿瘤发展进程和化疗敏感性的分子标记。本文介绍了SLFN家族蛋白的分类、结构和主要特征、定位与功能,重点综述了其在肿瘤和病毒感染等相关领域的研究进展,以期为SLFN蛋白新功能的探究提供新思路,对蛋白发挥作用的可能机制给予提示,并为各相关领域的研究提供参考。

基于表达荧光蛋白的海分枝杆菌感染斑马鱼模型的抗结核药物评价方法的研究

目的为了提高基于荧光检测的海分枝杆菌-斑马鱼感染模型的灵敏度和准确度,我们构建了毒力较弱的可以表达红色荧光蛋白的重组菌Mm927-pR2HYG,建立了斑马鱼感染模型,用于抗结核药物的药效评价和筛选。方法重组菌Mm927-pR2HYG经受精卵卵黄囊注射感染斑马鱼幼鱼,通过测定斑马鱼致死率确定其对斑马鱼的感染性,并在激光共聚焦显微镜下观察其在斑马鱼体内的分布。同时应用荧光像素计数法对异烟肼和利福平的治疗效果进行评价。结果成功构建了表达荧光蛋白的重组海分枝杆菌Mm927-pR2HYG感染斑马鱼模型。异烟肼和利福平两种抗结核药物在该模型中均具有良好的治疗作用;应用荧光像素计数法和qPCR计数法进行的药效评价结果具有较好的一致性。结论重组海分枝杆菌Mm927-pR2HYG感染斑马鱼模型结合荧光像素计数法是一种快速、高效、直观的药物体内评价系统,可以用于抗结核药物的高通量筛选。

多靶点药物治疗前列腺癌研究进展

前列腺癌是男性群体中常见癌症,在所有癌症种类中,其致死率位列第六。治疗早期前列腺癌常用外科手术除和放射疗法然后辅以药物治疗,但是对于去势性抵抗前列腺癌（castration resistant prostate cancer,CRPC）,药物治疗仍然是首选策略。根据与前列腺癌有关的生物信号通路及靶标来开发抗前列腺癌药物是目前该类药物研发的常用方法。

基于虚拟筛选的新型吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂的发现及活性评价

目的应用药效团模型及分子对接的综合虚拟筛选策略,对Specs及Chembridge数据库进行筛选并进行生物学活性评价,以期发现新型吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO1)抑制剂。方法基于已报道IDO1抑制剂,利用Discovery Studio 2019软件的Pharmacophores(Hiphop)模块构建药效团模型。通过最优药效团模型初步筛选了Specs及Chembridge数据库,后采用LibDock及CDOCKER程序靶向IDO1活性位点进行层级分子对接,最终保留了40个苗头化合物,并在100μmol/L浓度下进行了细胞水平IDO1酶抑制活性初筛。选取初筛抑制率大于50%的11个化合物进行细胞水平及生化水平抑酶活性的进一步测定。采用SPR及分子对接模型进一步确证及阐明化合物与IDO1酶之间的相互作用方式。结果发现羟基嘧啶类化合物29在细胞水平及生化水平上均呈现了IDO1酶抑制活性,EC50和IC50分别为(53.93±1.22)μmol/L和(179±8.12)μmol/L。SPR研究进一步确证了化合物29与IDO1之间的直接结合(KD=65.92μmol/L)。分子对接模型研究显示羟基嘧啶基团与IDO1的卟啉环之间存在较为丰富的相互作用,是靶向识别的关键基团。结论羟基嘧啶类化合物29是一类新型IDO1抑制剂,可作为IDO1酶抑制剂的先导物,通过进一步结构改造及优化,有望获得高效、结构新颖的IDO1抑制剂及新型肿瘤免疫治疗药物。

以分泌型荧光素酶为报告基因的单轮感染流感病毒的构建

目的构建以分泌型荧光素酶为报告基因的单轮感染流感病毒用于药物作用机制的快速鉴别。方法通过使用分泌型荧光素酶(Gluc)序列替代流感病毒HA基因,并利用表达质粒反式提供HA蛋白,借助甲型流感病毒WSN反向遗传学产毒系统,构建带有报告系统的单轮感染流感病毒。结果首轮接种单轮感染流感病毒的细胞上清中可以检测到Gluc信号,但检测不到病毒滴度,而在第二轮感染的细胞上清中检测不到Gluc信号,表明该单轮感染病毒在感染过程中能够分泌Gluc蛋白并且不能产生具有感染性的子代病毒颗粒。通过对复制动力学和时相的观察,明确了单轮感染病毒的生活周期,同时结合4种已知作用机制的抗流感药物的阻断实验结果,证明该系统可以用来快速、有效地鉴别药物的作用机制。结论成功构建了以分泌型荧光素酶为报告基因的单轮感染流感病毒,该系统可以用于抗病毒药物作用机制的快速鉴别。

以KRAS为靶标的抗结肠癌药物筛选系统的构建及应用

目的构建以KRAS为靶标的抗结肠癌药物筛选系统,为抗结肠癌药物筛选提供新的技术手段。方法首先选取细胞系并确定系统的技术参数,构建以KRAS为靶标的抗结肠癌药物筛选系统,设计实验验证筛选系统的有效性;而后将构建的筛选系统初步应用,筛选化合物库Z183593-L1200,并对筛选结果进行验证,验证筛选系统的可行性。结果完成筛选系统构建后,通过筛选系统(in-cell Western blot)测得的Hce8693和T47D细胞的KRAS表达差异与普通Western blot一致,筛选系统测定的siRNA系统的敲低效率与普通Western blot亦一致,筛选系统的有效性得到初步验证。筛选激酶抑制剂化合物库Z183593-L1200后,选取活性最好的化合物PF-04691502进行验证;浓度梯度实验显示,随着PF-04691502浓度升高则KRAS胞内含量降低,KRAS胞内含量对PF-04691502浓度呈梯度依赖性;细胞增殖实验结果显示PF-04691502对Hce8693细胞的半数有效浓度(IC50)为3.546μmol/L,进一步验证了系统的可行性。结论所构建的以KRAS为靶标的抗结肠癌药物筛选系统具有一定有效性和可行性,能够用于以KRAS蛋白为药物靶点的药物高通量筛选,为抗结肠癌的药物研发提供了新的筛选方法。

HIV-1 Rev蛋白在病毒复制中的功能

人获得性免疫缺陷病毒 HIV-1 编码的 Rev 蛋白由116 个氨基酸组成,分子量为 19 kD,主要定位在细胞核中。Rev 具有三个不同的功能区:N 端的第 35 ~ 50 个氨基酸之间编码了一个精氨酸富集区域(arginine-rich-motif,ARM)作为 Rev 的核定位信号(nuclear localization signal,NLS)。Rev 的 NLS 区域主要负责蛋白的核定位功能以及与 Rev反应元件(Rev response element,RRE)的茎环 RNA 序列特异性相互作用,介导 Rev 单体间聚合[1]。Rev 的第 10 ~24 个氨基酸是核扩散抑制信号(nuclear diffusion inhibitorysignal,NIS),主要维持 Rev 的功能以及 Rev 在细胞核的亚细胞定位。第三个活性区域位于第 73 ~ 84 个氨基酸之间,是异亮氨酸富集的区域,包含一个核输出信号(nuclearexport signal,NES)。该区域直接与细胞染色体维持蛋白 1(chromosomal region maintenance 1,CRM1)相互作用。研究表明在 HIV-1 的复制过程中,Rev 执行了多种生物学功能,其中包括病毒 RNA(vRNA)的核输出、增强病毒蛋白的表达水平,促进 vRNA 基因组的核体化[2],以及负调控 HIV-1 整合[3]。本文主要围绕 Rev 在病毒复制早期和晚期的功能展开论述。

海分枝杆菌感染斑马鱼成鱼模型的构建

目的构建海分枝杆菌感染斑马鱼模型,对先导化合物的有效性及其代谢衍生物进行检测,以有效降低药物体内筛选的成本。方法采用海分枝杆菌感染斑马鱼成鱼,测定斑马鱼的存活率,用HE以及Ziehl-Neelsen染色的方式,观察斑马鱼体内肉芽肿形成情况,并对形成的肉芽肿数进行计数,用于评价抗结核药物利福平对斑马鱼成鱼结核病的治疗效果,结合细菌菌落定量PCR计算利福平给药的IC50值。结果成功构建了海分枝杆菌感染斑马鱼的抗结核药物筛选模型。利福平可以减少海分枝杆菌感染斑马鱼体内的肉芽肿数目和细菌数,对照组肉芽肿数目平均有28个,200μmol/L利福平给药组有5.6个,而利福平高剂量组未发现肉芽肿,两个治疗组与对照组相比均有显著性差异(P<0.05)。利福平成鱼给药的IC50值为52.5μmol/L。结论海分枝杆菌-斑马鱼感染模型结合细菌菌数定量PCR分析方法是一种简单、高效的抗结核药物体内筛选模型,可用于抗结核药物的筛选与评价。

杯鞘石斛中联苄类化学成分研究

通过多种色谱手段从杯鞘石斛Dendrobium gratiosissimum乙醇提取物分离得到了19个化合物,运用波谱学方法分别鉴定为杯鞘石斛酚A(1),4,4′-二羟基-3,5-二甲氧基联苄(2),3,4-二羟基-5,3′,4′-三甲氧基联苄(3),4-羟基-3,5,4′-三甲氧基联苄(4),鼓槌石斛素(5),3,4′-二羟基-4,5,3′-三甲氧基联苄(6),3,4,4′-三羟基-5,3′-二甲氧基联苄(7),3-羟基-5,3′,4′-三甲氧基联苄(8),4′-羟基-3,5,3′-三甲氧基联苄(9),3,5,3′,4′-四甲氧基联苄(10),3,3′-二羟基-5-甲氧基联苄(11),杓唇石斛素(12),3,4-二羟基-5,4′-二甲氧基联苄(13),石斛酚(14),3,4′-二羟基-5-甲氧基联苄(15),2,6-二羟基-4-甲氧基-9,10-去氢菲(16),4,5-二羟基-2,6-二甲氧基-9,10-二氢菲(17),3,4-二羟基-5,4′-二甲氧基二苯乙烯(18)和4-羟基-3,5,4′-三甲氧基二苯乙烯(19)。其中化合物1为新化合物,化合物2~10,16,18和19为首次从该植物中分离得到。体外药理活性测定结果表明:化合物4对人肝癌细胞株HepG2有一定的抑制作用(IC50为10.15μmol·L-1);化合物7和12对HIV病毒具有中等强度的抑制作用,IC50分别为9.35,9.15μmol·L-1;化合物10对IAV病毒具有中等强度的抑制作用,IC50为8.90μmol·L-1。

BST-2抑制HIV-1病毒样颗粒释放的研究

BST-2是最近发现的可以抑制成熟HIV-1(human immunodeficiency virus,HIV)病毒颗粒从哺乳动物细胞表面释放的宿主因子,随之发现其也可以抑制多种包膜病毒的释放。本研究采用密码子优化的表达HIV-1 gag和gag-pol蛋白的质粒所形成的病毒样颗粒作为研究对象,观测BST-2对这两种病毒样颗粒(Virus-like particle,VLP)的释放抑制情况及其作用机制。结果发现,瞬时表达和稳定表达的BST-2均可以显著抑制病毒样颗粒从哺乳动物细胞释放,同时发现这两种病毒样颗粒(gag/gag-pol)的释放都可以被BST-2抑制;而且,HIV-1中Vpu蛋白可以拮抗BST-2抑制HIV病毒样颗粒释放的作用,另外,通过化学试剂和酶学方法处理,确证BST-2可以被包装进病毒样颗粒中。

BST-2和Vpu相互作用抑制剂筛选模型的建立

骨髓基质细胞抗原2(Bone marrow stromal cell antigen 2,BST-2,又称Tetherin、CD317、HM1.24)是宿主先天性免疫应答的组成部分,可抑制人类免疫缺陷病毒1(Human immunodeficiency virus 1,HIV-1)的释放,HIV-1的辅助蛋白Vpu可通过跨膜区与BST-2的跨膜区产生相互作用,进而将其降解,下调其在细胞表面的数量,拮抗BST-2的抗病毒功能。本研究将海肾荧光素酶(Renilla luciferase,Rluc)与BST-2的N端连接,增强型黄色荧光蛋白(Enhanced yellow fluorescent protein,EYFP)与Vpu的C端连接,分别构建质粒RB和VE,使两种融合蛋白在细胞内共表达,产生生物发光共振能量转移(Bioluninescence resonance energy transfer,BRET)信号,进而建立稳定双表达细胞系,以BST-2和Vpu的跨膜区相互作用为靶点,应用BRET技术,建立两种蛋白相互作用抑制剂的筛选模型,以期通过BRET信号变化筛选出相互作用抑制剂,发展新型的艾滋病治疗手段。