一种检测安丝菌素效价的生物检定方法——木霉平板法

本文报道一种安全高效的安丝菌素生物检定方法。对1株安丝菌素敏感的真菌进行了ITS序列系统进化树分析,确定其属于木霉属,并将其命名为木霉CPCC 400749。采用PDA培养基制备了木霉CPCC 400749检定平板并用于测定安丝菌素效价,测定结果与HPLC分析方法得到的数值基本一致。本文报道的安丝菌素生物检定方法具有安全高效特点,有望用于高通量筛选束丝放线菌安丝菌素高产菌株。

链霉菌CPCC 203577产生的napyradiomycins的分离与鉴定

目的对一株具有抗菌活性的链霉菌CPCC 203577产生的次级代谢产物进行系统研究。方法采用ISP2琼脂平板发酵培养链霉菌CPCC 203577,乙酸乙酯提取发酵培养物,获得粗提物;粗提物经反相色谱柱、凝胶色谱柱、制备型TLC和半制备HPLC等分离纯化获得目标化合物纯品;MS和NMR等确定化合物结构;琼脂稀释法测定抗菌活性。结果从链霉菌CPCC 203577中分离鉴定了含萘醌并吡喃母核的3个已知化合物,3-chloro-6,8-dihydroxy-8-α-lapachone(1)、16-dechloro-16-hydroxynapyradiomycin C2(2)和napyradiomycin A2(3)。化合物1具有较强的抗革兰氏阳性细菌活性,最低抑菌浓度(MIC)值为4~8μg/ml;化合物2和3没有抗菌活性。结论链霉菌CPCC 203577具有丰富的次级代谢产物合成能力,产生napyradiomycins类化合物。

珍贵束丝放线菌产生的新代谢产物1-羟基-4-O-鼠李糖-2-萘甲酸甲酯

目的发现珍贵束丝放线菌ATCC 31565产生的新代谢产物。方法TLC和LC-MS等分析珍贵束丝放线菌ATCC 31565培养物的乙酸乙酯提取物,发现目标化合物。采用MCI色谱柱和半制备HPLC等分离纯化目标化合物。对目标化合物的NMR等数据进行分析,确定其化学结构。结果从珍贵束丝放线菌ATCC 31565中发现了一个化学结构为1-羟基-4-O-鼠李糖-2-萘甲酸甲酯的新化合物,并将其命名为珍贵酚。结论推测珍贵酚是1,4-二羟基-2-萘甲酸(甲萘醌的生物合成前体物)和L-鼠李糖这两个初级代谢产物的脱水缩合产物再经过甲酯化形成的。

链霉菌Streptomyces sp.CPCC 204095产生原黄醇酮C的固态发酵及制备

目的以链霉菌Streptomyces sp.CPCC 204095为产生菌,建立小规模发酵培养及分离纯化制备原黄醇酮C的方法。方法HPLC测定原黄醇酮C发酵效价;利用改进的发酵培养基配方对链霉菌Streptomyces sp.CPCC 204095进行固态发酵培养,经乙酸乙酯提取、正相硅胶色谱柱和反相ODS色谱柱分离纯化制备原黄醇酮C。结果采用改进的发酵培养基配方(葡萄糖4 g/L,麦芽提取物25 g/L,酵母提取物4 g/L,黄豆饼粉6 g/L,琼脂粉15 g/L,pH自然),原黄醇酮C发酵效价达到300 mg/L;从5 L发酵培养基出发,经发酵培养和分离纯化后,收获原黄醇酮C样品656 mg,HPLC检测纯度91%。结论建立了一种简便高效的原黄醇酮C小规模发酵和制备工艺流程,为开展原黄醇酮C化学衍生物和生物活性等研究奠定了基础。

URA3基因影响青蒿酸酿酒酵母工程菌中试发酵产量

CRISPR/Cas9基因编辑技术已经被广泛应用于工程酿酒酵母的基因插入、基因替换和基因敲除,通过使用选择标记进行基因编辑具有简单高效的特点。前期利用CRISPR/Cas9系统敲除青蒿酸生产菌株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)1211半乳糖代谢负调控基因GAL80,获得菌株S.cerevisiae 1211-2,在不添加半乳糖诱导的情况下,青蒿酸摇瓶发酵产量达到了740 mg/L。但在50 L中试发酵实验中,S.cerevisiae 1211-2很难利用对青蒿酸积累起到决定性作用的碳源-乙醇,青蒿酸的产量仅为亲本菌株S.cerevisiae 1211的20%–25%。我们推测因遗传操作所需的筛选标记URA3突变,影响了其生长及青蒿酸产量。随后我们使用重组质粒pML104-KanMx4-u连同90 bp供体DNA成功恢复了URA3基因,获得了工程菌株S.cerevisiae 1211-3。S.cerevisiae 1211-3能够在葡萄糖和乙醇分批补料的发酵罐中正常生长,其青蒿酸产量超过20 g/L,与亲本菌株产量相当。研究不但获得了不加半乳糖诱导的青蒿酸生产菌株,同时首次发现了营养缺陷型标记URA3基因显著影响乙醇补料的中试发酵中青蒿酸的产生,也为酵母作为底盘来进行其他天然产物的生产提供了借鉴。