雷帕霉素聚乳酸-聚乙醇酸共聚物纳米粒子对人脐动脉平滑肌细胞细胞周期时相、p27蛋白表达及细胞增殖的影响

目的评估本实验室自制包载雷帕霉素(RPM)的聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)纳米粒子(NPs)对离体培养的人脐动脉平滑肌细胞(HUASMC)细胞周期时相、p27蛋白表达和细胞增殖的影响。方法按不同浓度RPM-PLGA NPs设定药物作用组,并设立RPM组、PLGA组和M231培养基及平滑肌细胞生长添加剂(M231-SMGs)组作为对照。采用细胞免疫组织化学染色比较不同处理组HUASMC p27蛋白表达阳性率和表达水平的差异,流式细胞技术评价各处理组对HUASMC细胞周期时相的影响,噻唑蓝(MTT)比色法观察不同浓度RPM和RPM-PLGA NPs对HUASMC存活率的影响。结果10μg/L及以上浓度的RPM和50μg/L及以上浓度的RPM-PLGA NPs可明显抑制HUA-smc生长,并呈浓度依赖性。细胞计数绘制生长-时间曲线显示,100μg/L RPM和500μg/L RPM-PLGA NPs作用于HUASMC 24 h后细胞计数值明显低于M231-SMGs对照组;单纯PLGA NPs对细胞生长无明显影响;与PLGA组和M231-SMGs培养基对照组相比,RPM组和RPM-PLGA NPs组G_0/G_1期细胞比例明显增多,S期及G_2/M期细胞比例明显减少(P均<0.01),但两组间细胞周期时相比例差异无统计学意义(P>0.05)。细胞免疫组织化学染色结果显示,100μg/LRPM和500μg/L RPM-PLGA NPs组的HUASMC p27蛋白表达阳性率和表达水平与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05),但均较PLGA组和M231-SMGs培养基组明显增加(P<0.01)。结论RPM-PLGA NPs抑制体外培养的HUASMC生长效果与RPM相似,并可显著抑制体外培养HUASMC p27蛋白表达,阻抑其细胞周期进程于G_1/S期而抑制其细胞增殖。

包载雷帕霉素的乳酸-乙醇酸共聚物纳米粒子对人脐动脉平滑肌细胞bcl-2、p27^(kip1)表达及细胞凋亡的影响

目的观察雷帕霉素(RPM)及其乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)形成的载药纳米粒子(RPM-PLGA-NPs)在不同浓度和作用时间下对离体培养人脐动脉平滑肌细胞(HUASMCs)细胞凋亡及调控基因bcl-2、p27kip1表达的影响。方法离体培养HUASMCs细胞并分别予不同浓度的RPM、RPM-PLGA-NPs作用12和24 h,设立生理盐水及空白PLGANPs对照组,免疫组织化学方法检测p27kip1与bcl-2表达阳性率和表达水平的差异,采用流式细胞仪、DNA片段琼脂糖凝胶电泳及末端原位标记法检测各组HUASMCs凋亡及细胞凋亡率,噻唑蓝比色法观察不同浓度RPM和RPM-PLGA-NPs对HUASMCs存活率的影响。结果 RPM及RPM-PLGA-NPs组抑制HUASMCs增殖并呈剂量依赖关系,HUASMCs DNA电泳呈梯度条带阳性。流式细胞仪检测RPM 100 ng/ml和RPM-PLGA-NPs 500 ng/ml组的细胞凋亡百分率分别为(45.45±2.36)%和(35.04±5.64)%,显著高于对照组的(2.60±0.95)%(P<0.01)。末端原位标记法检测高剂量干预组的24 h凋亡指数显著高于12 h组(P<0.05,P<0.01)。RPM 100 ng/ml组和RPM-PLGA-NPs 500 ng/ml组的p27kip1蛋白阳性表达指数(PEI)分别为(0.178±0.077)%和(0.192±0.052)%,显著高于对照组的(0.101±0.035)%(P<0.05)。Spearman秩相关检验显示RPM及RPM-PLGA-NPs组凋亡指数值与p27kip1的PEI无相关性。RPM-PLGA-NPs 50 ng/ml及RPM 10 ng/ml组bcl-2的PEI分别为(6.44±1.31)%和(5.49±1.06)%,显著高于对照组的(1.84±0.47)%和(2.06±0.53)%(P<0.05)。结论 RPM及RPM-PLGA-NPs上调离体培养的HUASMCs的p27kip1表达、促进细胞凋亡,并无下调抗细胞凋亡基因bcl-2表达的作用。相当载药量的RPM-PLGA-NPs较RPM促进血管平滑肌细胞凋亡的作用更明显,但与p27kip1表达水平无线性相关。

包载雷帕霉素的聚乳酸-聚乙醇酸纳米粒子对小型猪冠状动脉损伤后平滑肌细胞增殖的影响及机制

目的研究局部血管内灌注包载雷帕霉素（RPM）的聚乳酸-聚乙醇酸共聚物（PLGA）纳米粒子（NPs）对损伤-狭窄小型猪冠状动脉损伤后平滑肌增殖、基质金属蛋白酶（MMP）-2、基质金属蛋白酶抑制物（TIMP）-2及p27^kip1mRNA表达的影响。方法28头小型猪模型随机数字表法分为4组，每组7只，冠状动脉过大球囊损伤后经Dispatch^TM球囊局部分别灌注生理盐水、5．0mg／ml空白NPs、1．0mg／ml RPM和5．0mg／ml RPM—PLGA NPs。手术第30天复查造影并留取冠脉标本。评价干预前后各组冠脉造影血管狭窄程度，切片常规行苏木精-伊红、Weigert氏间苯二酚复红和苦味酸-天狼星红染色并行形态学比较。免疫组化染色法检测增殖细胞核抗原（PCNA）、MMP-2、TIMP-2，原位杂交法检测p27^kip1 mRNA表达水平。结果共21头小型猪完成实验：生理盐水组、空白PLGANPs组、RPM组及RPM—PLGANPs组分别6、4、5、6头。各组间损伤-狭窄模型造成的即刻损伤程度无统计学意义，RPM—PLGANPs组第30天造影血管狭窄程度明显低于生理盐水和空白NPs组（P〈0．01）和RPM组（P〈0．05）。RPM—PLGANPs组新生内膜面积NIA、内外弹力板围绕面积比值及增生指数显著小于其他三组（均P〈0．05），而最大内膜厚度MIT、内弹力板围绕面积IELA大于其他三组（均P〈0．05）。RPM—PLGANPs组阳性区域平均积分光密度值为0．35±0．06，显著高于空白NPs组（0．12±0．05，P〈0．01）及生理盐水、RPM组（0．16±0．03和0．15±0．03，P〈0．05），MMP-2／TIMP-2比值及PCNA组化染色阳性表达指数及均低于其余三组（均P〈0．05）。结论RPM-PLGA NPs结合Dispatch^TM球囊血管腔内给药抑制损伤后小型猪冠状动脉VSMC增殖和细胞外基质生成而抑制再狭窄发生，是用于治疗血管增殖性疾患有临床前景的手段之一。