两种消化液传代培养的人脂肪干细胞生物学特性比较研究

目的比较两种消化试剂传代对人脂肪干细胞生物学特性的影响,探寻可替代胰蛋白酶的细胞消化试剂。方法采用类胰蛋白酶(TrypLE Express)与胰蛋白酶(Trypsin)两种细胞消化试剂,对原代提取的人脂肪干细胞生物学特性及成脂分化能力进行比较。结果第三代脂肪干细胞在TrypLE^(TM) Express与Trypsin试剂消化条件下活细胞百分比无显著性差异(P>0.05)。流式细胞仪检测结果表明,CD90、CD73、CD105等细胞表面抗原标志物呈现阳性表达,CD11b、CD34、CD19、CD45、HLA-DR等呈现阴性表达,两组消化试剂作用下阳性细胞的百分比无显著性差异(P>0.05)。成脂诱导细胞脂滴染色结果用Imagepro plus进行半定量分析,两组消化试剂作用下成脂分化率无显著性差异(P>0.05),接种第1~7天细胞增殖能力无明显差异(P>0.05)。结论两种消化试剂作用对人脂肪干细胞生物学特性的影响无显著性差异,TrypLE Express可完全代替Trypsin用于脂肪干细胞体外传代培养。

胰岛素样生长因子和胰岛素样生长因子结合蛋白在软骨细胞生长和发育过程中的调控作用研究进展

胰岛素样生长因子(Insulin-like growth factors,IGFs),是机体生理情况下调控生长和发育的重要生长因子。IGFs在长骨发育,即软骨内化骨的调控中发挥重要作用。IGF-I参与调节了间充质干细胞的成软骨过程并进而参与了软骨组织稳态的保持。胰岛素样生长因子结合蛋白(Insulin-like growth factor-binding proteins,IGFBPs)代表了一个能与IGF-I和IGF-2相结合的进化上保守的蛋白质家族,包括6个独立的家族成员IGFBP1、2、3、4、5、6,它们具有调控和储存转运IGFs的作用以及独立于IGFs的作用,在机体生长和发育中发挥重要的功能,在软骨组织的发育中同样扮演着重要的角色。本文综述了IGFs和IGFBPs对软骨细胞生长和发育的生理调节功能,从而为IGFs在软骨组织工程领域的应用提供参考。

玻璃化冻存骨髓基质干细胞的实验研究

目的:骨髓基质干细胞(BMSCs)是构建组织工程化骨主要的种子细胞,实现BMSCs的深低温保存对骨组织工程具有重要意义。目前,玻璃化冻存是最有发展前景的冻存方法,因此希望通过改进玻璃化液和预处理条件来提高BMSCs的玻璃化冻存效果。方法:采用不同组成及浓度的玻璃化液在不同的预处理条件下对第2(P2)代成骨诱导的犬骨髓基质干细胞(cBMSCs)进行玻璃化冻存实验,通过复苏后的细胞存活率来选择一种理想的玻璃化液及适合的预处理条件,并在此基础上再与常规冻存的实验结果进行比较,同时考虑冻存过程对细胞成骨活性的影响。结果:将VS226作为玻璃化液,在0℃/5min的预处理条件下玻璃化冻存P2代成骨诱导的cBMSCs,与常规冻存后的细胞存活率相比无统计学差异,且冻存过程对此细胞的成骨能力没有影响。结论:采用VS226来玻璃化冻存BMSCs,可实现为骨组织工程提供大量种子细胞的目的。

深低温保存组织工程化骨的实验研究

目的:深低温保存是组织工程化骨(TEB)实现大规模临床应用的必要保证。深低温保存方法分慢速冻存和玻璃化冻存。目前,玻璃化冻存是最有发展前景的冻存方法,并被认为更适用于TEB的深低温保存。因此,希望通过改进玻璃化液来提高TEB的玻璃化冻存效果。方法:通过检测第2(P2)代成骨诱导的犬骨髓基质干细胞(cBMSCs)在部分脱钙骨(pDBM)上的粘附率和生长曲线来获得适宜的细胞接种密度和体外培养时间,将在此基础上构建的TEB进行深低温保存。由TEB冻存后的细胞活性来选择一种理想的玻璃化液,并将其用于玻璃化冻存和慢速冻存TEB的对比实验研究。结果:P2代成骨诱导的cBMSCs在pDBM上适宜的细胞接种密度是50×106/ml,最佳的体外培养时间是8天。VS442作为玻璃化液用于TEB的深低温保存。尽管玻璃化冻存TEB的细胞存活率仅为46.2%±7.2%,低于慢速冻存的77.4%±5.1%,但经过体外培养11天后的细胞活性超过了后者,可基本恢复到冻存前的水平。结论:VS442是玻璃化冻存TEB理想的玻璃化液。尽管实验采用的慢速冻存方法可简单有效的保存TEB,但对于TEB而言,玻璃化冻存还是更具有发展潜力的深低温保存方法。

人间充质干细胞表面标记分子的研究进展

间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cell,MSC)可作为理想的种子细胞参与组织器官的修复过程。但由于不同分离方法得到的间充质干细胞的纯度不同,极大地影响了治疗效果的稳定性。因此,利用其表面标记分子进行鉴定分选,成为当前干细胞领域研究的热点。本文就人MSC表面标记分子的分类、功能、应用以及稳定性等方面进行综述。

股深动脉穿支皮瓣应用于乳房再造的解剖学研究

目的为股深动脉穿支皮瓣应用于乳房再造提供解剖学依据。方法5例10侧成人新鲜下肢尸体标本进行乳胶或氧化铅动脉灌注，解剖观察后区域血管的形态及分布，测量股深动脉穿动脉穿支血管数量、管径、血管蒂长度及伴行静脉管径。在此基础上进行了股后区穿支皮瓣切取的手术模拟。结果股深动脉第1穿动脉发出4-9支穿支供应股后区皮肤，以肌皮穿支为主，偶可见肌间隔穿支；降支优势较多，优势穿支多发自股后内侧。血管蒂长为（10．6±2．6）cm，其外径为（2．2±1．0）cm，伴行静脉外径分别为（1．8±0．8）mm与（2．1±1．8）mm。结论股深动脉穿支皮瓣血供存在个体差异，尤以第1穿动脉对其影响较大，有待进一步研究确保皮瓣切取的安全性与精确性。

股深动脉穿支供血的横半月形股薄肌肌皮瓣的解剖研究及在乳房再造中的应用

目的为股深动脉穿支供血的横半月形股薄肌肌皮瓣在乳房再造中的应用提供解剖学依据，并探讨将其做成穿支皮瓣的可能性及大隐静脉属支在该皮瓣的分布规律。方法在4例8侧灌注红色乳胶的成人尸体下肢标本上对股薄肌上股深动脉穿支的出现率及其在股薄肌内的走行、血管外径、血管蒂长度以及伴随静脉和神经情况等进行解剖学观测。结果股深动脉股薄肌支在股薄肌肌皮瓣中的出现率为100％，其中75％来自于股深动脉，25％来自于旋股内侧动脉。穿支入肌点距股薄肌起点为（13．21±1．03）em，入肌处动脉外径（1．35±0．30）mm，沿途发出2～3只皮支，血管蒂动脉起点外径（2．77±0．54）mm，蒂长为（74．14±9．42）mm。伴随静脉终点外径（2．83±0．63）mm，大隐静脉属支在皮瓣范围内出现率87．5％，除1例无大隐静脉属支分布外，其余7例标本均有1支属支，外径为（2．60±0．64）mm。闭孔神经外径（1．85±0．53）mm。结论①股深动脉穿支在股薄肌中上1／3处出现率高，分布具有规律性，可以作为乳房再造的可靠供区；②皮瓣范围内存在较为恒定的大隐静脉的属支，可以作为皮瓣的第二套静脉系统予以保留以获得更好的静脉回流；③存在将横半月形股薄肌肌皮瓣做成穿支皮瓣的可能，在适合的病例中可以考虑减少肌肉的携带量以减少供区损伤；④股深动脉穿支供血的横半月形股薄肌肌皮瓣经标本手术模拟，证明切实可行；⑤供区关闭后切口瘢痕隐蔽，患者更易于接受；⑥根据胸部乳腺切除后缺损大小设计皮瓣，皮瓣宽度以供区能直接拉拢关闭为准，不仅可用于整个乳房的再造，而且适合于保乳术后乳房局部缺损的修复，对于双侧缺损的患者可以提供双侧皮瓣作为供区。

组织工程骨血管化策略的研究进展

骨组织工程的发展为大段骨缺损的修复提供了新的途径,众多的动物实验研究和逐渐兴起的临床应用研究已充分显示出其巨大的应用前景。然而,组织工程骨细胞支架复合物在植入体内后,尤其植入血供不佳的受区时,因不能及时地与机体建立起血供连接,使得成骨效果不稳定。近年来的研究表明,组织工程骨的血管化已成为构建大段组织工程骨的一个关键因素。我们对组织工程骨血管化策略的研究进展进行综述。

组织工程皮肤血管化研究进展

血供对于皮肤的维持和移植至关重要,尽管组织工程皮肤已经商业化并应用于临床,但仍未能很好地实现其血管化。目前,促进组织工程皮肤血管化主要是依靠促血管形成的种子细胞,以及多种生长因子的作用。随着诱导多功能干细胞、静电纺丝,以及生物打印技术的发展,也可以通过设计新型支架,并结合相应的种子细胞和细胞因子,精确地模拟体内生长环境,以促进组织工程皮肤的血管化。本文主要对近年来组织工程皮肤血管化的研究进展进行综述。

半侧颜面短小畸形的病因学研究进展

半侧颜面短小畸形(Hemifacial microsomia,HFM)是仅次于唇腭裂的最常见的先天性面部畸形,涉及颅面骨骼、肌肉、软组织、面神经、外耳及颅外器官。病变多为单侧,少数累及双侧。半侧颜面短小畸形的病因及发病机制尚不明确,文献报道的发病原因包括遗传、环境,以及两者的相互作用。本文对半侧颜面短小畸形的病因学研究进行归类和总结。

应用iPSC技术构建疾病模型的研究进展

诱导多能干细胞(iPSC)技术用于构建体外疾病模型的基本步骤是:诱导体细胞重编程为亚全能干细胞,再将这些细胞分化为相关疾病的受累细胞亚型,模拟疾病特征并重建病理过程,为研发治疗方法提供资料。

毛囊单位促进组织工程皮肤形成的体外实验研究

目的通过插入分离的毛囊单位,构建带有皮肤附属器的组织工程皮肤,探讨毛囊对组织工程皮肤形成的作用。方法将头皮分离成毛囊单位,插入由Ⅰ型鼠尾胶原、成纤维细胞和角质形成细胞构建的组织工程皮肤模型中,浸没培养1周,气-液界面培养3周。通过镜下观察、HE染色和免疫组化检测组织工程皮肤和毛囊的生长状态。结果相对于悬浮培养的毛囊,实验组毛囊体外生长期延长,结构更完整。HE染色显示,实验组组织工程皮肤可见毛囊和皮脂腺存在。免疫组化染色显示,带有毛囊的组织工程皮肤中可见反映基底膜完整性的Laminin和Ⅳ型胶原呈线状连续分布于表皮、真皮连接处;而反应表皮成熟度的CK4和CK10/13则呈阳性分布于基底上层非角化细胞。结论复合毛囊单位可以促进组织工程皮肤表皮组织的分化和成熟。本方法为组织工程皮肤的构建和毛囊的体外培养提供了新的思路和方法。

非编码RNA对毛囊调控作用的研究进展

随着二代测序技术的进步和生物信息学的发展,非编码RNA(ncRNA)已不再被认为是“转录杂音”,而是以RNA的形式在转录水平、转录后水平以及表观遗传学水平等水平调控基因表达。目前,有关ncRNA在免疫系统疾病、恶性肿瘤中的研究已较为广泛,但对于其在毛囊中的作用尚不清楚。许多信号通路和分子参与毛囊的形态发生和再生,如Wnt/β联蛋白、音猬因子和骨形态发生蛋白等。非编码RNA,尤其是微RNA、长链ncRNA和环状RNA,通过调控这些信号通路,在毛囊发育、分化和毛发周期中具有重要作用。未来,应深入探索毛囊相关ncRNA的作用及调控机制。

力学刺激提高生物3D打印软骨构建物基质的形成

背景:基质分泌不均匀、力学强度不足是影响组织工程构建物在体内形成效果的重要因素,力学刺激是促进细胞外基质分泌的有效手段。目的:探索3D生物打印复合支架在力学加压环境下的生物学表现。方法:采用3D生物打印技术制备软骨细胞-甲基丙烯酰胺基明胶复合支架,活死染色观察细胞存活情况。将复合支架置于力学加压生物反应器中进行加压培养,以6孔板中不加压培养的复合支架为对照,活死染色观察细胞存活情况,组织学染色观察复合支架体外软骨形成情况,qRT-PCR检测成软骨相关基因mRNA的相对表达量。将加压与不加压复合支架分别植入裸鼠皮下,5周后取材,组织学观察软骨形成情况。结果与结论:①复合支架外观呈现清晰的网格状结构,体外培养1,4,7 d时,支架形态稳定、结构清晰,细胞存活率均在90%以上;②培养2周后,加压组复合支架中的细胞存活率低于不加压组(P<0.05);苏木精-伊红染色显示两组复合支架均有明显的软骨陷窝结构,细胞在材料中分布较均匀,加压组复合支架的材料间空隙内有更多新生软骨组织形成;番红O染色显示两组均可见红色软骨基质形成,加压组细胞周基质染色更深;Ⅰ型胶原免疫组织化学染色显示,加压组着色更为明显;加压组弹性蛋白、Ⅱ型胶原的mRNA表达高于不加压组(P<0.05);③植入裸鼠皮下5周后,苏木精-伊红染色显示加压组软骨组织形成更为均一,软骨细胞大小均匀,陷窝结构明显;④结果表明,虽然体外加压刺激会引发3D生物打印软骨细胞-甲基丙烯酰胺基明胶复合支架中的细胞死亡,但同时会促进存活细胞向支架空隙间长入,提高其软骨基质相关基因的表达,促进成软骨能力。

大鼠颅骨缺损模型在骨组织工程中的应用

目前，颅、颌面骨缺损的修复对于整形外科和口腔颌面外科的治疗仍是挑战。用于修复骨缺损的骨移植材料若想应用于临床，必须要具备可充分提高体内骨愈合能力的组织学证据，而通过不同方法将不同的骨移植材料进行动物实验不失为一种行之有效的检测方法。但如果在实验动物模型的选择上缺乏一致性，则很难客观地比较各种移植物之间的修复效果，只有采用标准动物模型才能有效地对其效果进行评估。

一种提取全血基因组DNA的改良方法

目的：将碘化钾法和试剂盒法相结合,建立一种安全无毒、快速、经济、有效的提取全血基因组DNA的方法。方法：用0.2%Na Cl裂解红细胞收集全血中的白细胞,用5 mol/L KI裂解白细胞膜,再用试剂盒提取DNA,采用紫外分光光度仪、凝胶电泳、荧光定量PCR进行检测。结果：本法提取300μL抗凝血可得基因组DNA 5~12μg,D260nm/D280nm为1.86±0.02。原本提取100次全血基因组DNA的试剂量提升到可提取200次。结论：改良法提高了试剂盒的使用率,所得基因组DNA稳定,是一种操作简便、快速高效并节省试验经费的提取方法。

保存条件对提取全血基因组DNA质量的影响

目的比较从新鲜和冻存全血中提取基因组DNA的效果。方法分别取300μL抗凝新鲜和-75℃冻存3个月的血样,用全血基因组DNA提取试剂盒抽提基因组DNA,通过紫外分光光度计、电泳、PCR进行检测。结果抗凝新鲜和冻存血样提取的基因组DNA总量分为:(16.62±12.12)μg和(7.94±4.18)μg;纯度分别为(1.85±0.01)和(1.84±0.02)。结论新鲜血样提取的基因组DNA总量要高于冻存血样差异显著,纯度无显著差别,低温冷冻保存使提取全血基因组DNA的产量降低。

两种提取冻存全血基因组DNA方法的比较

目的比较两种不同方法提取冻存全血中基因组DNA的效果和特点。方法分别用改良碘化钾法和Promega全血基因组提取试剂盒提取全血基因组DNA,通过紫外分光光度仪、凝胶电泳、PCR进行检测。结果改良碘化钾法和试剂盒法提取的基因组DNA浓度分别为(330.9±0.94)ng/μL和(490.3±3.16)ng/μL;纯度为(1.87±0.03)和(1.85±0.06)。试剂盒法提取的基因组DNA含量稍高于改良碘化钾法,质量和纯度无显著差异。结论试剂盒法更简便、快速、无毒地进行提取DNA,但价格较贵;改良碘化钾法价格低廉,适合大量临床血液标本的提取,能够满足分子生物学实验的需要。

KLF2和KLF15基因在hBMSCs定向分化中的动态表达

目的研究KLF2和KLF15在人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)成脂、成骨和成肌分化过程中的表达水平及变化趋势,探讨KLF2和KLF15在hBMSCs定向分化过程中可能的作用方式。方法密度梯度离心法分离hBMSCs,流式细胞仪检测细胞表面标志物,取第4代细胞分别进行成脂、成骨和成肌诱导并以油红O、茜素红及免疫荧光染色进行鉴定。通过实时定量PCR和免疫荧光分别从mRNA水平和蛋白水平检测相关标志物、KLF2、KLF15和GLUT4的表达。结果体外培养的hBMSCs表达间充质干细胞表面标志CD29、CD90,并在特定诱导剂作用下能够定向分化为脂肪细胞、成骨细胞和成肌细胞,染色鉴定结果为阳性,并分别检测到相关标志基因的表达;hBMSCs成脂、成骨和成肌过程中KLF2、KLF15和GLUT4的表达均呈动态变化。结论 KLF2和KLF15与hBMSCs成脂、成骨和成肌分化的启动和维持有关;KLF2和KLF15可能通过GLUT4调节能量代谢从而影响hBMSCs定向分化。

人骨髓间充质干细胞体外成骨与成脂分化过程中FGF1及其受体表达的变化

目的研究人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)成骨与成脂分化过程中成纤维细胞生长因子1(FGF1)及其受体(FGFRs)的动态表达,探讨FGF1在hBMSCs成骨与成脂分化过程中的作用。方法密度梯度离心法分离hBMSCs,取第3代细胞分别进行成骨和成脂诱导分化并染色鉴定。通过real-time PCR方法检测成骨和成脂标志基因以及FGF1/FGFRs的表达,免疫荧光染色法检测诱导分化前后FGF1的表达。Real-time PCR及油红O染色鉴定外源性FGF1对hBMSCs成骨与成脂分化的影响。结果体外诱导hBMSCs成骨和成脂分化后茜素红和油红O染色结果呈阳性;FGF1和FGFRs在诱导过程中呈动态表达;免疫荧光染色结果表明FGF1主要在细胞质中分布,成骨诱导3 d后在细胞核中的表达增加;相比对照组,加入外源的FGF1组7 d后脂滴数量明显减少,成脂标志基因表达受到抑制(P<0.01),而加入外源的FGF1 3 d骨桥蛋白(OPN)表达升高(P<0.05)。结论 FGF1能够抑制hBMSCs的成脂分化,并且可能通过促进骨桥蛋白表达而提前hBMSCs的成骨矿化。