蜘蛛抱蛋属药用植物分子鉴定研究

通过比较各分子标记的PCR扩增成功率、测序效率、种内与种间变异和鉴定成功率等指标,考察6个分子标记(rbcL、matK、psbA-trnH、psbK-psbI、核ITS和ITS2)及其组合对蜘蛛抱蛋属药用植物的鉴定结果,评价不同标记在蜘蛛抱蛋属药用植物中的鉴定能力,确定适合该属鉴定的DNA分子标记。结果显示,对蜘蛛抱蛋属11个种20个样本进行分析,rbcL、matK、psbA-trnH、psbK-psbI序列获得率较高,matK鉴定成功率在获得的单一序列中最高(85%),多序列组合在鉴定效率方面比单一序列有所提高,其中matK+psbK-psbI的鉴定成功率为100%。因此,matK+psbK-psbI可用于蜘蛛抱蛋属药用植物的鉴定。

基于COI条形码序列的《中国药典》动物药材鉴定研究

药用动物是我国中药资源的重要组成部分,线粒体COI基因被公认为动物界中标准的DNA条形码基因,但利用此技术系统研究药用动物或动物药材鉴定的报道不多。本研究选取药典中45个动物药材,涉及基原物种51种,分析样品COI序列的种内种间变异情况,barcoding gap,鉴定效率等,考察COI序列鉴定动物药材的有效性和准确性。结果表明,种间变异最小值远大于种内变异最大值,barcoding gap图显示种间变异和种内变异重合较少,鉴定效率较高,除节肢动物门外,在物种水平和属水平上,鉴定效率均为100%,所构建的动物药材及其混伪品的NJ树能很好地区分正品来源与其混伪品。因此COI序列作为DNA条形码适用于药典中动物药材的鉴定。本研究为COI条形码准确鉴定药典中动物药材提供了分子依据,扩充了DNA条形码数据库中药用动物序列,并建立了利用此技术鉴定动物药材的具体技术流程。

糖基转移酶在植物次生代谢途径中的研究进展

糖基转移酶(GT)是能够催化糖基从激活的供体转移到特定的受体分子上的一类酶,在生物体中普遍存在,形成超基因家族。糖基转移酶广泛参与植物生命活动的各种生物学过程,尤其在植物次生代谢途径中发挥重要作用。本文概述了糖基转移酶在植物次生代谢途径中的研究进展,描述了该基因家族及其与植物次生代谢途径进化的关系,并总结了目前糖基转移酶类基因克隆的方法和新策略。

中药DNA条形码鉴定中的DNA提取方法研究

目的:建立一种直接从药材中提取DNA的方法以满足中药材DNA条形码研究的需要。方法:以麦冬药材为实验对象,对比5种常用植物DNA提取方法,筛选出最优方法后,对不同部位入药的10种中药材进行DNA提取,采用琼脂糖凝胶电泳及PCR扩增效果进行检测。结果:改良的CTAB法较适合药材DNA提取,虽然所有样品DNA都出现降解,但基于ITS2序列引物PCR扩增成功率为90%。结论:通过增加药材的预处理、核分离液等步骤,并改良CTAB浓度等措施,CTAB法能够用于上述不同药用部位入药的9种药材DNA提取,可以为中药DNA条形码鉴定中的DNA提取提供参考。

基于ITS2序列鉴定川贝母及其混伪品基原植物

本研究对川贝母5种不同基原植物ITS2序列进行PCR扩增和测序;同时扩大研究范围,从GenBank上下载川贝母及其常见混伪品共10个物种13个样本的ITS2序列。用MEGA4.1计算其种间、种内的K-2-P距离,并分析各样本间ITS2序列二级结构的差异,最后利用ITS2序列重构其系统发育树。结果显示川贝母基原植物种内最大K-2-P距离为0.0276,与混伪品的种间最小K-2-P距离为0.0583;川贝母及其混伪品的ITS2二级结构存在明显差异;重构的系统发育树显示川贝母不同基原物种聚为一支,能较好与混伪品区分。研究结果表明ITS2条形码序列能够成功鉴定川贝母及其混伪品的原植物,为川贝母混伪鉴别提供了新工具。

基于ITS2条形码序列的山豆根基原植物及其混伪品的DNA分子鉴定

山豆根是我国常用中药材,对山豆根基原植物及其易混伪品进行DNA分子鉴定研究具有重要意义。本文对5科9属38个物种84份山豆根基原植物及其混伪品样品的ITS2序列进行序列变异分析、K-2p遗传距离比较及NJ系统发育聚类树构建。结果表明所研究山豆根基原植物样品种内ITS2序列无变异,与其同属密切相关物种的ITS2序列变异位点为102个,平均K-2p遗传距离为0.072,与其他混伪品的ITS2序列变异位点为200个,平均K-2p遗传距离为0.594。山豆根基原植物在NJ系统发育聚类树上聚为一支,支持率为98。因此,ITS2作为DNA条形码序列能够有效的区分山豆根基原植物及其混伪品,为山豆根药材及其混伪品的鉴定提供基础。

基于SNP位点鉴定砂仁药材物种

目的:为建立基于单核苷酸多态性(SNP)技术鉴别砂仁3个基原(阳春砂Amomum villosum、海南砂Amomum longiligulare、绿壳砂Amomum villosum var.xanthioides)的方法,对这3个种共计60份材料ITS2序列进行分析比较。方法:将实验所得砂仁ITS2序列,应用CodonCode Aligner软件进行序列拼接比对。用MEGA 5.0导出各序列变异位点,并对变异位点进行分析。为验证结果准确性,下载砂仁3个基原GenBank的所有ITS2序列,共计34条,对结果进行验证。结果:砂仁ITS2序列比对后长度为230 bp,3个不同基原在135 bp和199 bp处存在稳定SNP(s)变异位点。结论:本研究开发的两个稳定的SNP(s)位点可以快速准确地鉴定砂仁药材3个基原。

细胞色素P450在人参皂苷生物合成途径中的研究进展

细胞色素P450(CYP450)是一类超基因家族编码的单加氧酶,参与萜类、生物碱和甾醇类等多种次生代谢产物的合成与代谢。CYP450对人参皂苷三萜碳环骨架进行羟基化和氧化等一系列复杂修饰作用,是人参皂苷生物合成途径中的关键酶。近年来利用新一代测序技术及生物信息学分析等方法,从CYP450家族中筛选出参与人参皂苷生物合成的相关CYP450s,并对候选基因(CYP716A47)进行了生物功能验证,进一步阐明了人参皂苷合成途径。本文对人参皂苷生物合成途径做简要介绍,并对近年来CYP450在人参皂苷生物合成途径中的研究进行综述,为阐明人参皂苷合成途径及通过基因工程手段合成人参皂苷提供理论依据。

肉苁蓉药材市场调查及规格等级标准

肉苁蓉是我国常用补益类名贵药材,具有补肾阳、益精血、润肠通便等功效。同时,肉苁蓉(荒漠)还被国家卫生健康委员会列入既是食品又是中药材的物质名单,日常使用需求量大。市场上肉苁蓉分级混乱、标准不一,不同商品规格的肉苁蓉价格相差很多。通过对本草典籍、国家标准、行业标准及文献中肉苁蓉规格等级标准进行梳理及对各大药材市场的实际分级情况和商品价格进行调研,分析基原、产地因素、野生来源与人工种植、采收季节、生育期、生长年限和个体大小等与规格等级有关的因素对肉苁蓉药材质量的影响,提出了根据基原区分规格,以产地、生育期和个体大小划分等级的建议标准,以期为肉苁蓉商品规格等级的优化提供参考。

本期专题讨论之一：中药资源可持续利用的技术研究

随着经济社会的发展,中药产业作为我国的民族产业,重要性日益突显。我国80%左右的中药材来自野生,其中大量的物种处于濒危状态,如冬虫夏草、川贝母、石斛、甘草、肉苁蓉等,资源走向衰竭。如何协调药材的可持续利用与生态环境保护的关系,是中药资源可持续利用的关键问题之一。

冬虫夏草菌寄主小金蝠蛾人工饲养成虫生物学特性

小金蝠蛾是冬虫夏草菌的优良寄主之一,人工培育成虫能否正常交尾及产卵直接关系到种源的持续利用,是目前冬虫夏草人工培育产业的制约因子之一。本文通过对人工饲养小金蝠蛾两个世代(R1、R2)成虫的形态、羽化、交尾、产卵、寿命等生物学特征与其野生亲本进行比较,研究人工培育条件下小金蝠蛾成虫的交尾、产卵能力,为人工培育种源及种群的可持续利用提供依据。研究结果表明,人工饲养条件下小金蝠蛾成虫的平均体长、体重、含卵量、产卵量、寿命均为野生亲本>R1>R2,但在羽化、交尾、产卵等行为上野生亲本与R1、R2不存在明显差异;人工饲养两个世代幼虫的种群增长率分别为177.27%和117.56%,表明人工饲养条件下小金蝠蛾种群可实现持续利用。

金银花种质资源遗传多样性的ISSR分析

目的:探讨金银花种质资源的遗传多样性,为其育种提供参考。方法:对采自金银花主产区的18个农家品种及野生忍冬和近缘种灰毡毛忍冬共计36个样品进行ISSR-PCR分析,采用NTSYS-pc软件计算金银花不同农家品种及近缘种间的Jaccard遗传相似系数,按非加权配对算术平均法(UPGMA)建立所研究类群的系统聚类图。结果:12条引物共扩增出129个条带,其中多态带为114条,占总扩增条带数的88.37%,金银花种质资源具有较丰富的遗传多样性。从聚类分析图可以看出,金银花不同样本首先聚在一起,表明是一自然类群;野生忍冬与栽培品种具有明显的遗传差异;主产区传统品系毛花系列遗传相对较稳定,而鸡爪花系列品种繁杂,遗传变异大;新品种九丰一号已独立成一稳定品种。结论:ISSR标记可以为金银花的种质资源鉴定、遗传关系分析及栽培育种提供分子生物学依据。

蛇足石杉1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(HsDXR1)基因克隆与表达分析

基于本实验室已获得的蛇足石杉转录组数据,获得一个编码1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase,DXR)的转录本,分析其开放阅读框序列,发现该转录本编码全长为1 440 bp的蛇足石杉DXR基因(HsDXR1),含有479个氨基酸残基。采用RT-PCR方法获得了HsDXR1全长,并对HsDXR1编码蛋白的理化性质、结构域及三维结构进行预测分析。结果显示HsDXR1编码蛋白的预测分子量为51.496 1 kDa,等电点为6.44;不含信号肽和跨膜区;亚细胞定位预测表明该蛋白最可能定位于叶绿体;具有DXR蛋白典型的结构域。实时荧光定量PCR检测HsDXR1基因在蛇足石杉的茎中表达量最高,其次为根,在叶中表达量最低。本研究获得了蛇足石杉HsDXR1基因的编码区序列,为进一步研究HsDXR1在蛇足石杉萜类化合物生物合成途径中的功能奠定基础。

海上丝绸之路上的重要资源——辣木叶茶

辣木是分布于热带、亚热带地区的一种珍贵树种,其各部位均具有较高的营养与医疗价值,其叶在历史上一直作为食物和药物在世界各地广泛使用,对于辣木叶茶的研究与开发也愈来愈受世界瞩目。本文就我国及世界辣木种植情况、辣木叶发展现状、辣木叶化学成分和辣木药效与安全性研究进行了评述。辣木叶茶对诸多慢性退行性疾病具有较好的防治效果,具有重要的药用和商业价值,是海上丝绸之路上的一个值得深入研究的重要资源,值得重视与关注。

蛇足石杉HsCAS1基因克隆及序列分析

本研究对蛇足石杉(Huperzia serrata)环阿屯醇合成酶(Cycloartenol synthase,CAS)基因HsCAS1编码区进行克隆及序列分析。根据本实验室已获得的蛇足石杉转录组数据,从中获得1条具有环氧角鲨烯环化酶保守结构域的编码CAS的转录本,采用RT-PCR方法获得该基因的编码区序列,并对HsCAS1蛋白进行理化性质、蛋白二级结构及三维结构预测分析。利用实时荧光定量PCR方法检测HsCAS1基因在蛇足石杉的根、茎、叶中的表达情况。序列分析表明,所克隆的HsCAS1基因编码区长为2,271 bp,编码756个氨基酸残基,HsCAS1与紫果冷杉(Abies magnifica)的CAS具有61%的序列相似性。生物信息学预测HsCAS1蛋白含有3个跨膜区,具有萜类环化酶等保守结构域,不含信号肽。HsCAS1在蛇足石杉的根中表达丰度高于茎和叶。本研究在国内外首次获得蛇足石杉HsCAS1基因的编码区序列,为进一步研究HsCAS1在石杉科植物甾醇合成途径中的功能及鉴定酶活性位点奠定基础。

基于ITS2序列鉴定金樱子及其伪品

目的：本文选用金樱子作为研究对象验证DNA条形码鉴定中药材的稳定性及准确性。方法：通过改良的CTAB法提取10份样品的基因组DNA,扩增得到ITS2片段。将得到的片段进行双向测序,运用软件CodonCode Aligner进行拼接,其它6份样品来源于GenBank。将金樱子与混伪品ITS2序列应用MEGA 5.0软件进行序列比对,计算种内、种间距离,构建邻接树（neighbor-joining tree,NJTree）。结果：金樱子药材ITS2序列长度为219~221 bp,存在两个Poly C结构。金樱子种内平均Kimura 2-parameter（K-2-P）遗传距离为0.005,远小于与混伪品的种间平均K-2-P遗传距离0.574。NJ树结果表明金樱子与混伪品分为两枝,Bootstrap支持率为99%,表现出良好的单系性。结论：ITS2序列作为DNA条形码能准确稳定的鉴别金樱子药材,本研究为保证金樱子临床用药安全提供了技术保障。

有毒中药土荆皮的ITS2条形码序列分析鉴定

目的:本文选用土荆皮及其5种伪品共37份材料,对ITS2序列进行比较研究。方法:采用CodonCode Aligner3.5.7进行序列拼接,MEGA5.0计算土荆皮的种内及其与混伪品的种间K2P距离,构建NJ分子系统树,并分析土荆皮及其混伪品ITS2序列二级结构的分子形态学特征。结果:土荆皮药材ITS2序列单倍型与其基原植物叶片序列一致;土荆皮及其混伪品的ITS2序列种间遗传距离远大于土荆皮种内样本的遗传距离;NJ树显示土荆皮样品单独聚为一支,药材土荆皮正伪品的ITS2序列二级结构差异显著。结论:ITS2可以作为土荆皮及其伪品鉴定的有效DNA条形码序列。