利福平类抗结核药物机制排重系统的建立

目的:以抗结核一线药物利福平耐药为研究目标,探索快速评价抗利福平耐药结核分枝杆菌活性的方法。方法:利用PCR技术扩增与利福平耐药相关的rpoB及其突变体,插入载体pMV261构建重组质粒,电击转化入耻垢分枝杆菌进行药物敏感性测定。结果:在利福平浓度为4μg/mL时,表达rpoB-AM和rpoB-GM突变体的重组菌耐药性明显高于未突变组,其MIC提高了4倍以上,而与野生株相比,MIC提高了8倍以上;以ATG为起始密码子表达蛋白组的耐药性都强于以GTG为起始密码组。结论:本研究建立的利福平类药物作用机制的排重系统,可以用于排除某种或某些作用机制相同或类似的活性化合物,避免重复筛选,提高筛选效率,对于抗利福平耐药株的抗结核药物的筛选有着重要意义。

埃博拉病毒进入抑制剂筛选模型的建立与应用

目的旨在以埃博拉病毒(EBOV)包膜糖蛋白(GP)为靶点,建立埃博拉病毒进入抑制剂高通量筛选模型,应用该模型筛选具有特异性抑制埃博拉病毒进入的活性样品。方法利用细胞水平重组病毒技术,分别用两株不同爆发时间的Zaire-EBOV的GP与HIV核心质粒(p NL4-3.Luc)共表达,制备重组病毒EBOV-GP-Old/HIV-luc和EBOV-GP-New/HIV-luc。利用ELISA和荧光素酶检测技术,优化病毒产量、感染性、感染剂量及荧光活性测定时间等因素,建立药物筛选模型。利用统计学参数及阳性化合物评估该模型的稳定性和灵敏性。应用该模型,对242个样品进行初步筛选,并通过与水泡性口膜炎病毒包膜蛋白包装的重组病毒VSVG/HIV-luc进行比较,以判断样品的特异性。结果该模型可用于靶向GP蛋白的埃博拉病毒进入抑制剂的高通量筛选,并获得4种具有特异性抗埃博拉进入活性的样品。结论该模型可用于抗EBOV进入药物的高通量筛选,应用该模型获得的阳性样品有助于抗EBOV药物的发现。

抗结核药物筛选模型荧光素酶报告系统的建立

目的:以ESX-1分泌系统为靶点,建立能够寻找既能抑制该系统发挥功能、降低结核菌毒力和细胞内生存力,又不抑制分枝杆菌生长、减少耐药性产生可能性的抗结核药物。方法:通过PCR的方法扩增得到Luciferase(LUC)、CFP-10及其突变体ΔCFP-10,应用搭桥的方法将二者融合,电击转化入海分枝杆菌,测定海分枝杆菌上清中LUC活性。结果:表达LUC-CFP-10的融合蛋白重组海分枝杆菌上清中荧光素酶的活性是表达末端缺失7个氨基酸的LUC-ΔCFP-10融合蛋白的10倍左右。结论:可以通过检测LUC-CFP-10蛋白的分泌,即通过测定海分枝杆菌上清中荧光素酶活性来反映ESX-1分泌系统的活性,而该分析方法可以发展成为寻找ESX-1抑制剂的高通量筛选方法。

抗HIV-1活性化合物作用靶点的快速判断方法

目前，艾滋病的防治工作主要依靠抗HIV-1药物，临床使用的抗HIV药物主要是逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、融合抑制剂和整合酶抑制剂。逆转录酶抑制剂包括核苷类逆转录酶抑制剂（NRTI），如Zidovudine（AZT）、Lamivudine（3TC）、Emtricitabine（FrC）等，非核苷类逆转录酶抑制剂（NNRTI），如Efavirenz（EFV）、Nevirapine（NVP）、Delavirdine（DLV）等。蛋白酶抑制剂主要有Ritanovir（RTV）、Saquinavir（SQV）、Indinavir（IDV）等。

异烟肼耐药耻垢分枝杆菌的建立及药物敏感性的测定

耐药结核病的涌现,使发展新型抗耐药结核药物变得尤为迫切。本研究选择生长快且无致病性的耻垢分枝杆菌为研究对象,探索快速评价药物抗异烟肼耐药结核分枝杆菌的能力。inhA是异烟肼的作用靶点,由于inhA的突变或者过表达可以引起结核分枝杆菌对异烟肼耐药性的产生。通过将inhA克隆入pMV261中,构建过表达inhA的耻垢分枝杆菌。结果显示,过量表达inhA的耻垢分枝杆菌对异烟肼的敏感性下降了100倍以上。建立了利用刃天青为指示剂的抗异烟肼耐药株的快速药效评价方法,可快速对药物的活性进行定性或定量评价,为进行新型抗结核药物的高通量筛选和药效评价奠定基础。