以PLK1 PBD为靶点的小分子抑制剂筛选及其抗癌活性研究

目的利用荧光偏振模型进行PLK1 PBD抑制剂的高通量筛选,并对阳性化合6143D7的抗癌效果进行体外评价。方法采用噻唑蓝比色法检测初筛阳性化合物对不同细胞系增殖的影响;流式细胞术检测化合物对细胞周期以及凋亡率的影响;分子对接检测化合物与PLK1 PBD结构域的亲和性。结果利用荧光偏振模型得到的阳性化合物6143D7经噻唑蓝比色法检测显示能抑制癌细胞的增殖;流式细胞仪检测显示该化合物加药组G2/M期细胞比例高于对照组并能促进细胞凋亡;分子对接结果表明化合物与PLK1 PBD结构域的亲和性良好。结论该化合物通过抑制PLK1 PBD结构域的活性发挥抗癌作用,有望成为靶向PLK1的抗肿瘤先导化合物。

PLK1 PBD靶向抗肿瘤抑制剂的筛选及活性研究

目的筛选靶向PLK1 PBD的抗肿瘤小分子抑制剂,对其抗肿瘤效果进行体外评价,为抗肿瘤药物提供先导化合物。方法利用荧光偏振模型初筛PLK1 PBD抑制剂;通过MTT法寻找初筛阳性化合物的敏感细胞系;利用流式细胞仪检测化合物对细胞周期和凋亡的影响;通过分子对接技术探讨化合物与PLK1 PBD结合方式;利用划痕实验测定化合物对肿瘤细胞迁移的影响。结果从20 000个化合物中筛选得到活性化合物1097C11,MTT结果显示其能抑制多种肿瘤细胞系的增殖;流式细胞仪检测其能够促进肿瘤细胞凋亡,在25μmol/L时,晚期凋亡达到77.02%;能导致细胞G1/M期阻滞,分子对接结果显示1097C11与PLK1 PBD结构域具有良好的亲和性,细胞迁移结果显示1097C11能够抑制HCT-116细胞的迁移,在20μmol/L时,迁移率低至33.4%。结论化合物1097C11具有较好的抗肿瘤活性,并有望成为靶向PLK1 PBD的抗肿瘤先导化合物。

结核分枝杆菌FtsZ抑制剂的筛选和活性研究

目的筛选结核分枝杆菌FtsZ的特异性抑制剂,为抗结核药物的研发提供先导化合物。方法应用本实验室已经建立的结核分枝杆菌FtsZ抑制剂筛选模型对化合物库进行筛选,获得能够抑制FtsZ的化合物202E,对其进行IC50以及分子水平活性测定,并利用DS 4.0软件将化合物202E与FtsZ的活性位点进行对接。结果化合物202E能够抑制结核分枝杆菌FtsZ的GTP酶活性,其IC50为15.46μmol/L。202E还能够抑制FtsZ蛋白的聚合。通过分子对接,发现202E能够与FtsZ的GTP结合位点结合,抑制FtsZ的GTP酶活性。结论化合物202E是活性较好的结核分枝杆菌FtsZ抑制剂。

以FtsZ为靶点的抗结核药物筛选模型的建立及应用

目的发现结核分枝杆菌Fts Z的特异性抑制剂,为开发针对该靶点的新型抗结核化合物奠定基础。方法克隆和表达结核分枝杆菌Fts Z蛋白并优化其酶活测活方法,构建Fts Z抑制剂的高通量筛选模型;对化合物库中2万个化合物进行筛选,将筛选得到的抑制剂212H进行IC50以及分子水平活性测定;用菌液稀释法评价212H对结核标准株、临床分离株以及耐药株的抗结核活性。结果得到了较纯的结核分枝杆菌Fts Z蛋白,建立并优化了Fts Z酶活测定体系以及其抑制剂的高通量筛选模型,筛选得到1个具有较高抑制率的抑制剂212H,该抑制剂具有显著的体外抗结核活性。结论建立了稳定的结核分枝杆菌Fts Z抑制剂的高通量筛选模型,应用该模型筛选得到的抑制剂具有抗结核活性。

化合物T44的抗肿瘤活性研究

目的评估化合物1-[4'-((3R,5R)-金刚烷基)苯基)]正丁胺盐酸盐(T44)的体外抗肿瘤活性,并初步探索可能的分子机制,为这种化合物的综合应用提供实验依据。方法四甲基偶氮唑蓝比色法检测T44对细胞的体外生长抑制作用;细胞形态观察法研究T44对细胞形态的影响;流式细胞仪法检测T44作用下肿瘤细胞周期和凋亡率的变化;蛋白印迹法检测T44对不同周期蛋白表达的影响;细胞划痕实验检测T44对肿瘤细胞迁移能力的影响。结果 T44对检测的11株肿瘤细胞的增殖均有抑制效果,对正常细胞人胚肺成纤维细胞也具有一定的增殖抑制作用,半数抑制浓度值为(16.58±3.49)μmol/L,高于受测的大部分肿瘤细胞;T44能导致肿瘤细胞凋亡和周期阻滞;T44能影响周期蛋白的表达并能降低HCT116细胞的迁移能力。结论 T44主要通过促进细胞凋亡来发挥抗肿瘤作用。

化合物5242331体外抗动脉粥样硬化的活性研究

目的发现新型抗动脉粥样硬化药物的先导化合物,并进行体外抗动脉粥样硬化活性研究。方法应用ABCA1和CLA-1表达上调剂筛选模型,对2000个化合物进行筛选,获得能上调ABCA1和CLA-1表达的化合物;利用RT-PCR和Westernblot方法研究化合物对目的蛋白的作用;利用巨噬细胞泡沫化实验测定化合物的体外抗动脉粥样硬化作用。结果 5242331在ABCA1和CLA-1上调剂模型上的EC50值分别为1.66和3.00μmol/L;进一步研究发现,5242331不仅能上调肝细胞HepG2中CLA-1的mRNA以及蛋白水平,还能上调巨噬细胞RAW264.7中ABCA1和SR-BI的mRNA以及蛋白水平;5242331能明显减少泡沫化巨噬细胞RAW264.7胞内脂滴量。结论化合物5242331具有较好上调ABCA1和CLA-1活性和较好的体外抗动脉粥样硬化效果,属首次报道。

靶向PLK1 PBD小分子抑制剂荧光偏振高通量筛选模型的建立

目的建立适用于靶向PLK1 PBD小分子抑制剂规模化筛选的荧光偏振高通量筛选模型。方法以pE T-28a-PLK1 PBD质粒转化E.coli Rosetta BL21(DE3),诱导表达并纯化PLK1 PBD蛋白。利用荧光偏振原理,以FITC-Poloboxtide作为分子探针,优选分子探针和PLK1 PBD最佳工作浓度,建立适用于PLK1 PBD小分子抑制剂筛选的荧光偏振高通量筛选模型。同时采用上述建立的荧光偏振筛选模型检测poloxin的抑制活性。结果成功诱导表达并纯化PLK1 PBD蛋白。选用30 nmol/L分子探针和200 nmol/L PLK1 PBD蛋白建立荧光偏振高通量筛选模型,其Z'因子可达0.74。基于该方法,检测poloxin的抑制活性,其IC_(50)值为(4.27±0.69)μmol/L。结论成功建立了适用于靶向PLK1 PBD小分子抑制剂筛选的荧光偏振高通量筛选模型。

以保罗样激酶1为靶点的抗肿瘤药物的筛选及活性评价

目的利用酵母模型进行保罗样激酶1(Polo-like kinase 1,PLK1)抑制剂的高通量筛选,并初步评估活性化合物的体外抗肿瘤效果。方法采用噻唑蓝比色法(MTT法)检测初筛阳性化合物对不同细胞系增生的影响,酶联免疫吸附测定法(enzymelinked immunosorbent assay,ELISA)分析化合物对体外纯化的PLK1激酶的作用效果,流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测细胞周期分布和凋亡率,免疫印迹(Western blotting)检测化合物对周期蛋白B1(cyclin B1)和PLK1的作用。结果利用酵母模型初筛得到3个阳性化合物,MTT法检测显示1号和3号化合物能抑制多种肿瘤细胞的增生而对正常细胞的毒性很小,ELISA结果显示2号和3号化合物对体外纯化的PLK1几乎无抑制作用,FCM检测显示1号化合物处理组G2/M期细胞比例高于对照组,Western blotting表明1号化合物不影响PLK1的蛋白表达,能导致cyclin B1的表达增加。结论 1号化合物通过抑制PLK1激酶的活性发挥抗肿瘤作用而不影响PLK1的蛋白表达,有望成为靶向PLK1的抗肿瘤先导化合物。

以FOXP3为靶点的免疫抑制剂药物筛选模型的建立

目的构建以FOXP3为靶点的免疫抑制剂筛选模型,用于筛选免疫抑制剂。方法以人类基因组DNA为模板,通过PCR扩增人类FOXP3基因启动子,将扩增的启动子DNA片段克隆至pGeneBLAzer-TOPO载体,以PCR方法确定插入片段方向,选取有正向片段的质粒克隆进行测序鉴定,用Lipofectine2000转染Jurkat细胞株,经G418抗性筛选获得阳性细胞克隆,通过PCR扩增鉴定阳性细胞克隆基因组中整合有FOXP3启动子/pGeneBLAzer-TOPO载体。以阳性对照前列腺素-2(PGE2)和PMA/Ionophore刺激细胞,探讨FOXP3启动子对下游报告子β-内酰胺酶活性的影响,并筛选了研究所内约2500余种天然产物。结果通过PCR成功扩增人类FOXP3基因启动子全长区域,构建了FOXP3启动子/pGeneBLAzer-TOPO载体,以PCR方法鉴定稳定转染细胞株Jurkat细胞基因组中整合有FOXP3启动子/pGeneBLAzer-TOPO载体,探讨了阳性对照PGE2和PMA/Ionophore对FOXP3基因启动子活性的影响,建立了以FOXP3为靶点的免疫抑制剂药物筛选模型,筛选了研究所2500余种天然产物,获得4个对FOXP3基因启动子具有上调作用的天然产物。结论建立了以FOXP3为靶点的免疫抑制剂筛选模型。

丹酚酸B在巨噬细胞胆固醇外排中的作用

目的考察丹酚酸B(SAB)对巨噬细胞胆固醇外排的影响。方法分别采用巨噬细胞RAW264.7和PMA诱导的THP-1细胞,利用流式细胞仪检测丹酚酸B对已摄取DiI-acLDL的细胞外排脂质作用的影响,对RAW264.7细胞表面ABCA1蛋白表达水平的影响。采用ABCA1的抑制剂DIDS及小分子干扰RNA的方法检测ABCA1在丹酚酸B诱导的促进脂质外排过程中的作用。进而利用靶向CD36的小分子干扰RNA,通过抑制CD36的表达,检测CD36在丹酚酸B促进载脂巨噬细胞脂质外排过程中的作用。结果采用DiI荧光标记的脂质检测巨噬细胞对脂质的外排作用,结果显示SAB显著增加了荷脂细胞对DiI-acLDL的外排作用。对脂代谢相关转运蛋白表达的检测结果显示,在荷脂的RAW264.7细胞中,SAB能够以一定剂量依赖的方式增加细胞表面ABCA1蛋白水平的表达。进一步研究显示,上述SAB促进外排的作用可被ABCA1的抑制剂或者siRNA的作用消除,确证了ABCA1在SAB介导的脂质外排过程中的重要作用。同样利用CD36小分子干扰RNA将CD36表达抑制后,SAB促进外排的作用消失,说明SAB介导的细胞脂质的外排作用同样依赖于CD36。结论丹酚酸B通过上调ABCA1的表达,促进巨噬细胞胆固醇或脂质的外排,且该作用依赖于ABCA1及CD36,为SAB抗动脉粥样硬化作用新机制的研究提供了重要依据。

ABCA1和SR-B1双重基因上调表达剂5242331的合成

苯并噻唑类化合物5242331是通过高通量筛选得到的小分子ABCA1和SR-B1双重基因上调表达剂,具有较好的抗动脉粥样硬化作用.以4-正丁基苯胺为原料,环合得到2-氨基-6-丁基苯并噻唑中间体1,3-氨基丙腈与4-氯磺酰基苯甲酸酰化得到4-[(N-氰乙基)氨磺酰基]苯甲酸中间体2,再与中间体1缩合合成了化合物5242331,收率为71.6%.

以聚酮合酶13为靶点的新型抗结核先导化合物的发现

目的发现结核分枝杆菌Pks13(MtPks13)的抑制剂,为后续针对以MtPks13为靶点开发抗结核药物奠定了基础。方法表达MtPks13-TE蛋白并优化其酶活测定方法,构建MtPks13抑制剂高通量筛选模型;与海分枝杆菌表型筛选方法联用,对5万个化合物进行筛选,将获得的抑制剂IMB-7142进行IC_(50)以及酶动力学性质的测定;表面等离子共振(surface plasmon resonance,SPR)实验以及分子对接模型研究阳性化合物IMB-7142与MtPks13-TE蛋白是否能发生相互作用及其作用位点;用菌液稀释法评价IMB-7142对结核标准株的抗结核活性。结果成功构建了MtPks13抑制剂筛选模型,并发现了一个对MtPks13有抑制作用,同时抑制海分枝杆菌生长的化合物IMB-7142,该抑制剂能与MtPks13-TE蛋白发生相互作用,具有较好的体外抗结核活性。结论成功构建了稳定的MtPks13抑制剂高通量筛选模型,并且应用该模型筛选得到的一个抑制剂同时具有抗结核活性,为后续开发以MtPks13为靶点抗结核药物提供了思路。

靶向FtsZ先导化合物的筛选及其抗结核作用探讨

目的:筛选可能作用于结核分枝杆菌Fts Z靶点的化合物,并且评价化合物的抗结核作用。方法:以结核分枝杆菌Fts Z为靶点,通过Discovery Studio虚拟筛选,选择候选化合物。测定候选化合物抑制Fts Z的GTP酶活性的IC50,并通过对耻垢分枝杆菌抑制的MIC评价其抗结核作用。结果:对化合物库(5 000个化合物)虚拟筛选,得到3个打分较高的化合物。体外实验发现这3个化合物能够在体外抑制结核分枝杆菌Fts Z的GTP酶活性,其IC50分别为9.96,14.02,16.17μmol·L-1。并且这3个化合物都具有抗耻垢分枝杆菌活性。结论:通过虚拟筛选得到的3个化合物将为抗结核药物的研发提供线索,也对药物虚拟筛选和基于结构的药物开发提供新的信息。

MTBD抗肿瘤细胞活性及作用机制研究

目的:对新发现的Aurora-B激酶抑制剂4-[2-(3-甲基噻吩-2-基)噻唑-4-基]-苯-1,2-二醇(MTBD)进行肿瘤细胞增殖抑制活性和作用机制的研究。方法:MTT法检测MTBD对肿瘤细胞的增殖抑制活性;流式细胞术检测MTBD对Hela细胞的周期阻滞和组蛋白3的磷酸化;ELISA方法检测MTBD对Aurora-B激酶的抑制活性;RT-PCR技术检测MTBD对S期检查点的相关蛋白转录水平的影响。结果:MTBD能够抑制Hela细胞、HepG2细胞和A549细胞的增殖,其IC50分别为(1.03±2.23)、(1.72±3.78)和(2.01±1.23)μmol/L;MTBD能够诱导Hela细胞发生G2/M期和S期阻滞,并诱导细胞发生凋亡;MTBD能够抑制Aurora-B激酶活性,其IC50为(1.70±2.02)μmol/L,但未能检测到Hela细胞内组蛋白3(Ser10)磷酸化水平下降;S期检查点相关基因p21和p53转录上调,CDK2、Cyclin A1和pCNA转录不同程度下调。结论:MTBD能抑制肿瘤细胞增殖,诱导细胞周期阻滞和凋亡;MTBD抗肿瘤活性的发挥可能不是主要通过Aurora-B激酶抑制,而是与多个细胞周期因子相关,并且对于不同肿瘤细胞株有不同的作用机制。