遗传性乳光牙本质家系致病基因突变的鉴定

目的对一个遗传性乳光牙本质（dentinogenesis imperfecta shieldstype Ⅱ ，DGI-Ⅱ）家系进行DSPP基因的突变分析。方法采集家系成员外周血或胎儿绒毛组织，用酚氯仿法提取基因组DNA。应用聚合酶链反应（polymerasechain reaction，PCR）-Sanger测序方法鉴定先证者DSPP基因第2～5外显子及外显子／内含子衔接区序列，并进行突变分析；针对突变位点设计错配引物引入AluI酶切位点，通过限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳方法在该家系正常人及60名无关正常个体中进行致病突变验证；构建含微型DSPP基因的pcDNA3．1基因表达载体，在体外培养细胞中验证突变致病性。结果该家系3例患者和一名胎儿均携带DSPP基因内C．52—1G〉A的杂合突变，突变造成该基因第3外显子5’端剪接点变异；60名对照者和家系正常个体均未携带该突变；微小基因（Minigene）体外表达显示e．52—1G〉A导致DSPP基因转录产物第3外显子的跳跃剪接。结论本研究在一个DGI-Ⅱ家系中发现了DSPP基因内一个新的致病剪接突变（c．52—1G〉A），并在此基础上为先证者提供了产前基因诊断。

成骨不全症家系C0L1A1／2基因的大片段缺失突变分析

目的在成骨不全症（osteogenesisimperfecta，OI）家系中进行COLlAl／e基因内大片段缺失突变的鉴定。方法应用多重连接探针扩增（multiplexligation-dependentprobeamplification，MLPA）方法对46例PCR-测序未见COLIAl／e基因突变的0I患者进行COL1A1／2基因大片段缺失突变检测，进一步应用荧光定量PCR或Gap—PCR-测序法对MLPA方法检测到的缺失突变进行验证。结果通过MLPA分析，在46例0I患者中检测到2例杂合性大片段缺失突变，先证者A为整个COL1A1基因的杂合缺失，先证者B为COL1A2基因第20外显子的杂合缺失；荧光定量PCR结果证实先证者A携带整个COLIAl基因的杂合缺失突变；Gap—PCR、DNA测序和凝胶电泳分析结果证实先证者B存在COLl4e基因内第17～23外显子的杂合缺失，断裂点区域有一个来自于5号染色体、长度637bp的DNA插入片段；先证者B家系成员突变验证显示其母亲为同一突变的杂合子。结论在中国人0I患者中发现了COL1A1和COL1A2基因的大片段缺失突变。本研究结果丰富了中国人群I型胶原相关OI致病基因突变谱，也为患病家系的产前基因诊断奠定了基础。

三个原发性肥大性骨关节病家系HPGD基因突变的鉴定

目的应用DNA测序和高分辨熔解曲线（high-resolution melting，HRM）分析技术对3个原发性肥大性骨关节病（primaryhypertrophicosteoarthropathy，PH0）家系进行HPGD基因的突变分析，了解中国PHO患者可能的热点突变。方法PCR扩增HPGD基因的全部外显子及外显子／内含子衔接区，并对PCR产物进行测序；针对先证者候选突变位点，通过HRM完成家系验证，并进一步通过基因测序技术对HRM方法的准确性进行鉴定。结果3例PHO先证者均存在HPGD基因第3外显子c．310_31ldelCT（P．L104Afs＊3）突变，其中2例为纯合子，1例为杂合子。对先证者和家系成员及正常对照样本的HRM分析结果显示3种不同的曲线型，经测序验证表明3种曲线分别为野生型与突变C．310-311delCT的杂合子和纯合子。结论L310-311del CT（P．L104Afs＊3）很可能是中国PHO患者的基因突变热点，HRM分析检测HPGD基因突变具有方便快捷、灵敏特异的优点，可作为PH0患者及携带者突变筛查HPGD基因突变的优选方法。