脑缺血再灌注损伤模型大鼠炎性反应相关信号研究

目的探讨脑缺血再灌注损伤模型大鼠的炎性反应相关信号链的变化,分析免疫系统炎性损伤与应激反应在中枢神经系统损伤过程中的作用及相互关系。方法采用改良Zea Longa方法制备Spraque-Dawley(SD)大鼠脑缺血再灌注损伤模型。将SD大鼠随机分为空白对照组、假手术组及模型组,采用免疫组化检测技术分析脑组织缺血局部炎性反应相关信号白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、细胞间黏附分子1(ICAM-1)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)和转化生长因子β(TGF-β)在12、24、48、72、96和144h的表达情况,采用ELISA方法检测相应时间点外周血中IL-1β、IL-6、TNF-α、热休克蛋白70(HSP70)和促肾上腺皮质激素(ACTH)的表达情况。结果模型组大鼠与假手术组及空白组大鼠比较,脑缺血损伤局部的炎性反应损伤相关信号IL-1β、IL-6、MMP-9、ICAM-1和TGF-β均表现为功能活动相关的增高表达,各指标相关信号随时间变化的趋势基本相似,呈经典的双峰形模式,24h～48h达到其表达量的第1个峰值,96h～144h达到其表达量的第2个峰值,未观察到TNF-α和MCP-1有相同的表达趋势;外周血中的炎性反应相关信号ACTH、IL-1β、HSP70和TNF-α亦表现为功能活动相关的增高性表达,模型组与假手术组及空白组大鼠比较其表达有统计学差异(P<0.05),各指标相关信号随时间变化的曲线峰形呈经典的单峰形模式,未观察到IL-6有相同的表达趋势。结论在脑缺血再灌注损伤情况下,中枢神经系统损伤局部及外周血中炎性反应相关信号呈活化状态,细胞因子参与了中枢神经系统局部的损伤及损伤修复过程和全身的网络功能调节,在中枢神经系统疾病发生发展过程中发挥关键作用。

神经免疫调节网络上传信号的细胞来源

目的通过比较不同免疫状态的Balb/c鼠和裸鼠中枢神经免疫调节相关脑区功能的差异,探讨外周免疫系统释放的神经免疫调节网络上传信号的细胞来源。方法 Balb/c鼠和裸鼠各50只,每种动物随机分成免疫2、4、6、8d组和健康对照组。应用免疫组织化学技术检测不同免疫时间点动物的神经免疫调节相关脑区下丘脑外侧区(lateral hypothalamic area,LH)和杏仁核前区(anterior amygdaloid area,AA)功能活化信号白细胞介素-1β(IL-1β)的表达水平,分析T细胞功能缺陷对神经免疫调节功能的影响。结果与健康对照组比较,Balb/c鼠免疫2、4、6d组LH、AA脑区IL-1β表达明显增高(P<0.05),且免疫后2d其表达即增高,免疫后4d达高峰,免疫后6d开始下降(均P<0.05),免疫后8d其表达量降至基础生理水平(P>0.05)。裸鼠免疫组LH、AA脑区IL-1β表达趋势与Balb/c鼠结果相似。裸鼠免疫组LH、AA脑区IL-1β表达水平与Balb/c鼠比较无统计学差异(P>0.05)。结论 Balb/c鼠与裸鼠经抗原免疫注射后均可启动LH、AA脑区的神经免疫调节功能,提示免疫系统功能活化后,向中枢神经系统上传的神经免疫调节功能启动信号由树突状细胞和T辅助细胞共同提呈,但主要来自树突状细胞。

hCaMKⅡNα对结肠肿瘤分泌免疫抑制因子的抑制作用

目的:探讨钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ抑制蛋白α(human calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡinhibitory alpha,hCaMKⅡNα)对结肠肿瘤细胞分泌免疫抑制因子的影响及其作用机制。方法:将hCaMKⅡNα基因表达载体(pKⅡNα)或siRNA(si-KⅡNα)转染至结肠肿瘤细胞(LoVo细胞、SW620细胞和HT29细胞),形成过表达或干扰表达细胞。RT-PCR检测结肠癌LoVo细胞过表达hCaMKⅡα后白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)、白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)和血管内皮生长因子(vascular endothelial cell growth factor,VEGF)mRNA表达水平,ELISA法检测转染pKⅡNα或si-KⅡNα对SW620和LoVo细胞中VEGF、PGE2、IL-8和IL-10分泌的影响。为观测细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases,ERK1/2)在hCaMKⅡNα介导的细胞因子调控中的作用,利用U0126抑制HT-29细胞中ERK1/2活性后,检测hCaMKⅡNα表达下调对VEGF和IL-8分泌的影响。结果:hCaMKⅡ可显著抑制结肠癌LoVo细胞中VEGF、IL-8和IL-10mRNA水平的表达;可抑制SW620和LoVo细胞中IL-8和VEGF蛋白的分泌,但对PGE2和IL-10的分泌没有影响。相应地,利用RNA干扰技术下调hCaMKⅡNα表达可显著上调HT29细胞中IL-8和VEGF的分泌;并且发现MEK1/2活性的抑制可完全阻断hCaMKⅡNα对IL-8的影响,但只能部分阻断对VEGF的影响。结论:hCaMKⅡNα通过抑制ERK活性下调结肠肿瘤细胞VEGF和IL-8的分泌,在结肠肿瘤免疫逃逸中起到负相调控作用。

TCRγ9/δ2(OT3)-Fc融合蛋白体内抗肿瘤效果研究

目的:研究TCRγ9/δ2(OT3)-Fc融合蛋白在体内抗肿瘤效果。方法:通过同位素99mTc标记技术观察TCRγ9/δ2(OT3)-Fc在荷瘤裸鼠体内的显像和分布,观察TCRγ9/δ2(OT3)-Fc对荷瘤裸鼠肿瘤生长和生存期的影响。结果:在荷瘤裸鼠体内99mTc-TCRγ9/δ2(OT3)-Fc与肿瘤组织有明显的结合,并且其可抑制荷瘤裸鼠肿瘤生长速度,延长小鼠生存期。结论:本研究初步证实TCRγ9/δ2(OT3)-Fc在荷瘤裸鼠体内有一定的抗肿瘤效果,为肿瘤靶向性抗体治疗提供了新的思路。

肿瘤囊泡:通向肿瘤免疫生物治疗之路

在发生凋亡和受到信号刺激时,细胞会释放直径为0.1~1μm的膜状囊泡,这样的膜状囊泡称之为微颗粒。其释放受到细胞骨架和生物机械力的影响,在正常细胞和恶性肿瘤细胞中起着传递信息的作用。最近笔者实验室通过肿瘤细胞来源的囊泡研发出一套新型的天然载药系统,其可以有效地将药物输送到肿瘤干细胞的细胞核,进而有效杀伤肿瘤干细胞而不产生副作用。其潜在的机制涉及肿瘤干细胞的柔软特性可以更好地摄取囊泡,载药囊泡进入溶酶体并促进溶酶体向细胞核运动进而将药物输送至细胞核。肿瘤细胞来源的载药囊泡已经进入临床试验,用于治疗梗阻性肿瘤和肿瘤导致的恶性积液。此外,肿瘤细胞来源的囊泡可以有效地被DC摄取,通过改变肿瘤细胞溶酶体的p H值以及激活DC的c GAS/STING通路产生Ⅰ型干扰素,进而促进DC对肿瘤细胞的抗原提呈,因而肿瘤细胞来源的囊泡可以作为理想的抗肿瘤疫苗。总之,肿瘤细胞来源的囊泡在今后的肿瘤免疫生物治疗和预防中有着广泛的应用前景。

抗人γδTCR单链抗体G5-4ScFv的制备及生物学功能分析

目的构建并应用原核表达体系表达能体外刺激人γδT细胞增殖的抗人γδTCR单链抗体。方法在成功建立稳定分泌鼠抗人γδTCR单克隆抗体杂交瘤细胞系G5-4的基础上,通过RT-PCR,扩增得到该单克隆抗体的重链(VH)和轻链(VL)可变区基因;通过搭桥PCR法,用连接肽(Gly4Ser)3,将VH和VL连接起来,构建了抗人γδTCR单链抗体G5-4ScFv基因。将该基因插入原核表达载体pET22b(+),并在大肠杆菌TransB(DE3)中经IPTG诱导表达。通过SDS-PAGE,Werstern blot进行鉴定,并通过流式、固相扩增、细胞因子检测、杀伤检测等方法分析单链抗体G5-4ScFv的生物学功能。结果单链抗体G5-4ScFv的相对分子质量约30 ku,能与γδTCR特异结合;固相化能刺激人PBMC中γδT细胞增殖,2周时其纯度可达90%;扩增得到的γδT细胞能有效杀伤肿瘤细胞系,如Daudi细胞,并在刺激时能有效分泌IFN-γ和TGF-α。结论成功构建并表达了具有生物学活性的抗人γδTCR单链抗体G5-4ScFv,为进一步研究其用于制备肿瘤过继免疫治疗用细胞制剂奠定了基础。

针刺对脑缺血再灌注模型大鼠脑组织基质金属蛋白酶、细胞间黏附分子表达的影响

目的探讨针刺对脑缺血再灌注模型大鼠脑损伤区组织基质金属蛋白酶(MMP-9)和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)表达的影响。方法以大脑中动脉栓塞法制备脑缺血再灌注模型,采用随机区组设计将大鼠分为电针、针刺、药物、针药结合、模型、假手术等6个大组,其中电针、模型、假手术组又分12、24、48、72、96和144 h 6个时间点以,另设空白对照组7只。HE染色检测损伤区组织形态学变化;免疫组化法检测MMP-9和ICAM-1积分吸光度值。结果 HE染色显示,梗死核心区病理损伤高峰时间出现在48 h;72 h后间质水肿减轻,大量小胶质细胞和胶原纤维增生,出现大量新生血管。免疫组化结果显示,MMP-9和ICAM-1在血管内皮细胞和炎性细胞及少数神经元广泛表达,缺血区明显高于自身对照区;组内比较显示表达呈48 h和144 h双峰形;组间比较显示,在48、72和96 h,电针组与其他实验组结果有显著差异。结论电针可能通过上调损伤-修复网络功能,促进梗死区神经功能的恢复。

雄激素受体和免疫系统

雄激素可以介导大量的生理反应，其作用是通过雄激素受体实现的。雄激素受体分为细胞内受体和膜受体。细胞内受体属于核受体家族，有3个结构域，分别是转录激活结构域、DNA结合结构域和配体结合结构域。膜受体是近年来新发现的一种雄激素受体，可能与G蛋白有关，引发细胞内Ca^2＋水平的升高，并产牛下游的一系列反应。近年来的研究显示，雄激素和雄激素受体与免疫系统有密切的关系，对其发育和反应性有重要影响。

CD11b^+ NKT细胞抑制Poly I:C诱导小鼠肝损伤中CD8^+T细胞增殖反应

目的:研究Poly I:C诱导的肝损伤模型中肝脏内上调的CD11b+NKT细胞对CD8+T细胞增殖反应的作用。方法:经腹腔注射Poly I:C(20μg/g)制备Poly I:C诱导小鼠肝损伤模型,流式细胞术检测CD11b+NKT细胞的比例、T细胞增殖反应和CD8+T细胞的杀伤功能,ELISA法检测细胞培养上清中的细胞因子浓度。结果:Poly I:C诱导的肝损伤模型小鼠的肝脏中CD11b+NKT细胞的比例显著上升[(71.7±5.3)%vs(12.4±3.6)%,P<0.01]。细胞因子表达谱分析发现,CD11b+NKT细胞分泌IFN-γ、IL-4和IL-10的能力显著低于CD11b-NKT细胞。功能分析发现,CD11b+NKT细胞能够显著抑制anti-CD3/CD28单抗诱导非特异性的和OVA特异性的CD8+T细胞增殖反应,而CD11b-NKT细胞没有此抑制功能;进一步分析发现,CD11b+NKT细胞并不影响CD8+T细胞的杀伤功能。结论:Poly I:C诱导的肝损伤模型小鼠肝脏中CD11b+NKT细胞比例升高,该细胞能够负反馈抑制CD8+T细胞的增殖反应,但是并不影响CD8+T细胞的杀伤功能。

小鼠脾脏来源的调节性表型γδT细胞的存在和体外诱导

目的:研究初始γδT细胞是否存在具有调节细胞表型的亚群,同时是否能够像CD4+CD25-T细胞一样可以在体外诱导产生具有调节表型的γδT细胞。方法:采用流式分选或磁珠分选的方法分离纯化脾淋巴细胞中γδT细胞,通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、实时定量PCR(Real-time PCR)和免疫荧光染色分析初始的γδT细胞以及TGFβ-(5ng/ml)诱导后的γδT细胞中Foxp3及部分调节性T细胞表面分子和细胞因子的表达情况。结果:与CD4+CD25+T细胞相比,初始的γδT细胞Foxp3表达量很低;活化的γδT细胞经过TGFβ-诱导后Foxp3表达量明显增加,同时与免疫调节相关的表面分子如GITR、CTLA-4和细胞因子TGFβ-、IL-10的表达量也相应增加,IFNγ-的表达有所降低。结论:初始的γδT细胞低表达Foxp3,在体外可经TGFβ-诱导产生具有调节性T细胞表型的亚群。

肿瘤免疫肿瘤免疫:肿瘤治疗的新希望

随着肿瘤学、免疫学及分子生物学等相关学科的迅速发展和交叉渗透,肿瘤免疫治疗技术突飞猛进,成为肿瘤治疗新的热点。肿瘤免疫治疗是应用免疫学原理和方法,提高肿瘤细胞的免疫原性和对效应细胞杀伤的敏感性,激发和增强机体抗肿瘤免疫应答,并应用免疫细胞和效应分子输注宿主体内,协同机体免疫系统杀伤肿瘤、抑制肿瘤生长。在某些肿瘤,如黑色素瘤、非小细胞肺癌等,免疫治疗展现出强大的抗肿瘤活性,部分免疫治疗药物已经获得美国FDA批准。2013年《Science》杂志将肿瘤的免疫治疗评为年度最重要的科学突破。免疫治疗成为继手术、放射治疗和化学治疗之后又一种重要的抗肿瘤治疗手段,成为攻克恶性肿瘤的希望。本文综述肿瘤免疫学的历史、发展规律、未来方向及中国的肿瘤免疫发展情况。