PBL教学法在协和研究生免疫学教学实践中的探索

基于问题的学习(problem-based learning,PBL)教学法在小班教学中易于开展,但如何在大班教学中取得良好的效果值得探索。本研究以研究生大班为对象,设计了一套PBL教学法,并以北京协和医学院研究生《基础免疫学》课程教学为实践模板,将传统讲授式理论授课与PBL教学法相结合,在实际应用中取得了良好的教学效果,为PBL在大班教学中的实践活动,提供了模板和思路。

DNA甲基化调控在免疫学研究中的进展

表观遗传学是研究基因序列不发生改变的情况下,基因表达发生了可以遗传的改变的一门学科。DNA甲基化是表观遗传学中进化上比较保守、相对比较稳定的一种表观修饰。DNA甲基化,特别是CpG岛的高甲基化,通常能够介导基因表达的稳定沉默。研究表明,DNA甲基化参与调控免疫系统的分化发育,DNA甲基化的异常也是包括肿瘤在内的众多免疫相关疾病发生、发展的关键致病因素。表观遗传学与免疫学的碰撞也为理解免疫学现象的分子调控机制提供了崭新的视角。本文将对近年来DNA甲基化调控在免疫学中的进展作一综述。

DDX60促进系统性红斑狼疮患者PBMCs中Ⅰ型干扰素的表达

目的探究DExD/H盒解旋酶60(DDX60)通过调控dsDNA-cGAS-IFN-Ⅰ通路对系统性红斑狼疮(SLE)进展的作用机制。方法通过分析RNA测序数据集发现DDX60 mRNA水平在SLE患者和健康人外周血单个核细胞(PBMCs)中的差异。分析SLE患者PBMCs的DDX60 mRNA水平与疾病活动度的相关关系。通过α干扰素(IFN-α)刺激人源单核细胞系THP-1,明确DDX60是否为干扰素诱导基因(ISG)。通过沉默和敲除DDX60,再转染双链DNA(dsDNA)poly(dA:dT),利用RT-qPCR检测β1干扰素(IFNB1)的mRNA水平。结果RNA测序数据集和RT-qPCR结果表明DDX60在SLE患者PBMCs中高表达。相关性分析表明,SLE患者PBMCs的DDX60 mRNA水平与疾病活动度呈正相关关系。IFN-α可以诱导THP-1细胞表达DDX60,表明DDX60是ISG。沉默DDX60后,poly(dA:dT)诱导的IFNB1 mRNA水平显著降低。结论DDX60在SLE患者PBMCs中高表达,IFN-Ⅰ-DDX60-dsDNA-cGAS-IFN-Ⅰ正反馈通路参与SLE进展,可能成为SLE临床诊治的靶点,具有诊断及预后评估价值。

脑类器官在药物研发中的研究进展

近年来,随着再生医学与组织工程学的飞速发展,脑类器官作为一种创新的体外模型系统,逐渐成为神经科学研究和药物研发领域的热点。脑类器官通过模拟人类大脑的复杂结构和功能,在体外重现了大脑发育的关键过程,为理解神经系统疾病机制、评估药物疗效及毒性提供了前所未有的平台。本文综述了脑类器官技术的最新进展,特别是其在药物研发中的应用,并探讨了该领域面临的挑战与未来发展方向。

CD44差异表达在胶质母细胞瘤中的生物信息学分析及细胞实验验证

目的探究CD44差异表达在胶质母细胞瘤(GBM)中的临床意义以及相关通路的富集并以胶质母细胞瘤细胞系U87进行实验验证。方法通过差异表达和Cox分析确定泛癌转录组中肿瘤患者与健康人的CD44表达是否具有差异以及风险比(HR);比较GBM患者CD44高、低表达组的免疫浸润及干细胞相关评分,并进一步分析各免疫细胞亚群是否具有差异及其与CD44的相关性;对GBM患者CD44高、低表达组差异表达的基因进行通路富集;通过构建、包装慢病毒和运用电转核糖核蛋白复合体的方法在U87细胞中过表达(OE)、敲低(KD)以及敲除(KO)CD44;对U87和U87 CD44 OE细胞进行CD44的免疫荧光染色;敲低CD44对U87细胞的活力与凋亡进行检测,敲除CD44对U87细胞的迁移与侵袭能力进行检测。结果CD44在GBM中表达较高与健康人差异明显(P<0.05),且HR>1。高表达CD44的GBM患者具有较高的基质细胞与免疫浸润评分以及较低的细胞干性,CD44高、低表达的GBM患者的树突状细胞、CD4^(+)记忆T细胞和调节性T细胞具有明显差异,且与CD44表达呈正相关(P<0.05)。CD44高、低表达的GBM患者的差异基因富集在与细胞迁移与凋亡的相关通路(P<0.05)。U87细胞实验表明,CD44正常情况定位在细胞膜,但CD44 OE后会在细胞质中发生蓄积。CD44 KD会导致细胞活力下降,细胞发生凋亡,CD44 KO的细胞迁移与侵袭能力也会下降(P<0.05)。结论CD44表达降低可以促进U87细胞活力降低、凋亡比例升高,侵袭与迁移能力下降,可能是影响GBM患者预后的相关因素。

昆虫杆状病毒表达系统表达TCRγ9/δ2-Fc融合蛋白及其生物学功能的初步鉴定

目的建立昆虫杆状病毒表达系统表达TCRγ9/δ2-Fc融合蛋白技术平台并鉴定其表达产物的生物学功能。方法用搭桥PCR获得γ9Fc和δ2(OT3)Fc基因片段,构建成pBACp10ph-γ9/δ2(OT3)-Fc重组质粒,与AcNPV昆虫病毒DNA共转染昆虫sf9细胞,表达TCRγ9/δ2-Fc融合蛋白;Western blot鉴定TCRγ9/δ2-Fc蛋白表达位置;胞内流式细胞仪检测γ9Fc和δ2(OT3)Fc两基因表达效率;蛋白G亲和层析后,SDS-PAGE鉴定蛋白纯度;激光共聚焦扫描显微镜技术和生物传感器技术检测了TCRγ9/δ2-Fc蛋白与SKOV3细胞和MNS蛋白的结合特性。结果成功构建pBACp10ph-γ9/δ2(OT3)-Fc表达载体,经鉴定发现TCRγ9/δ2-Fc蛋白在sf9细胞内表达,但γ9Fc和δ2(OT3)Fc两基因的表达效率有较大差异。纯化得到一定纯度的TCRγ9/δ2-Fc蛋白,并且具有与SKOV3细胞和MNS蛋白结合的特性。结论成功建立昆虫杆状病毒表达系统表达TCRγ9/δ2-Fc融合蛋白的技术平台,表达产物TCRγ9/δ2-Fc可以在体外模拟TCRγδ识别抗原的特性。

西达本胺对急性T淋巴细胞白血病CD8^(+)T细胞的调控作用研究

目的:探讨西达本胺对急性T淋巴细胞白血病CD8+T细胞的调控作用。方法:通过荧光定量PCR检测西达本胺处理的Jurkat细胞、淋巴细胞、与西达本胺处理的Jurkat细胞共培养的淋巴细胞的CXCL9、CXCL3 m RNA表达水平。通过流式细胞术检测西达本胺处理的淋巴细胞、与西达本胺处理的Jurkat细胞共培养的淋巴细胞中CD8+T细胞的比例。结果:西达本胺上调Jurkat细胞系CXCL9的m RNA表达,上调水平呈剂量依赖(r=0.950),西达本胺5μmol/L组的CXCL9 m RNA表达是无处理组的164倍。西达本胺上调淋巴细胞CXCL9的m RNA表达,上调水平明显低于同浓度西达本胺处理的Jurkat细胞系。与西达本胺处理的Jurkat细胞共培养,可以上调淋巴细胞中CD8+T细胞的比例。结论:急性T淋巴细胞白血病中,西达本胺可能通过上调肿瘤细胞CXCL9的表达,增加肿瘤微环境中CXCL9的浓度,导致CD8+T细胞数量的增加。

MAFB对肿瘤相关巨噬细胞极化及功能的影响

目的探究MAFB转录因子对实体肿瘤中巨噬细胞极化表型和功能的影响。方法通过Kaplan-Meier数据库的RNA-seq数据分析MAFB与乳腺癌和肺腺癌患者生存期的相关性;流式细胞测量术检测原代人单核细胞中MAFB的表达;RT-qPCR和Western blot检测人单核细胞白血病细胞系(THP-1)中敲低MAFB的表达水平;利用巨噬细胞体外极化、细胞共培养、RT-qPCR和流式细胞测量术检测巨噬细胞的极化表型;吞噬实验测定巨噬细胞的吞噬能力;体外杀伤实验测定巨噬细胞的肿瘤杀伤能力。结果与MAFB低表达组相比,MAFB高表达乳腺癌或肺腺癌患者生存期降低(P<0.05);蛋白质互作网络分析显示MAFB蛋白与巨噬细胞极化蛋白有相关性;与其他类型的组织细胞相比,人单核-巨噬细胞特异性高表达MAFB基因;佛波酯(PMA)诱导THP-1细胞分化后MAFB表达显著上调(P<0.05);在THP-1中敲低MAFB可以抑制M2相关基因表达(P<0.05);与肿瘤细胞共培养后敲低MAFB的巨噬细胞抑制其极化基因表达(P<0.05);敲低MAFB不影响巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬能力(P>0.05);敲低MAFB增强巨噬细胞体外肿瘤杀伤能力(P<0.05)。结论本研究初步证实在实体肿瘤中MAFB转录因子具有调控巨噬细胞的M2极化作用和抗肿瘤功能。

肿瘤免疫治疗和化疗的协同效应及其作用机制

近年来肿瘤治疗领域受到关注的热点之一是免疫治疗与化疗的联合应用,大量基础与临床的研究结果表明,恰当的免疫化疗(chemoimmunotherapy)能够取得较单一疗法更优的抗肿瘤效果,超越了以往认为化疗对免疫系统具有抑制作用、免疫治疗与化疗难以一起应用的传统观念。免疫化疗具有协同抗肿瘤效果的机制是多方面的,化疗可通过增强肿瘤细胞免疫原性、去除免疫抑制以及调节免疫应答反应等方式增强免疫治疗效果;另外,免疫治疗能够逆转肿瘤细胞的化疗耐药性,从而提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性并降低化疗的毒性作用等。目前,肿瘤免疫治疗与化疗协同作用的机制尚未完全清楚,相信通过其相关机制的不断阐明,将进一步提高免疫化疗的抗肿瘤效果并推动其临床应用。

免疫佐剂研发和临床转化的现状与发展趋势

免疫佐剂是能增强或改变抗原特异性免疫应答从而辅助疫苗发挥作用的制剂。大多数人体自发性肿瘤的免疫原性较弱,而免疫佐剂具有增强肿瘤抗原免疫原性、促进抗原提呈以及诱导机体产生抗肿瘤免疫应答等特性,这对提高肿瘤生物治疗效果具有重要意义。根据功能与机制的不同,可将佐剂分为免疫调节分子类、抗原递送系统类、免疫调节与抗原递送联合类三大类型。目前已有铝盐、乳剂、病毒颗粒、霍乱肠毒素和CpG ODN等佐剂获得批准用于人类疫苗或进入临床试验阶段,但由于安全问题、不良反应等限制因素及新型现代疫苗迅猛发展的需要,研发能与疫苗安全高效配伍应用的新型佐剂成为免疫临床转化研究的热点之一。本文归纳了免疫佐剂特性及其相关作用机制,介绍了免疫佐剂研究与临床转化的现状及新进展,讨论了该领域面临的挑战和可能的发展趋势。

冠状动脉血管重塑与脂代谢异常及斑块稳定性关系的初探

目的:以血管内超声法评价冠状动脉代偿性扩张与脂代谢异常及斑块性质之间的关系,并探讨血管重塑的可能机制。方法:将冠状动脉造影确定为单支局限性病变的56例患者,分为代偿性扩张组(30例)和无代偿性扩张组(26例)。对冠状动脉重塑指数和血脂成分做相关性分析,并对2组间血脂水平、超敏C反应蛋白(hs-CRP)、白介素(IL)-6、内皮素(ET)-1和不同斑块性质分布进行对比分析。结果:与无代偿性扩张组相比,代偿性扩张组患者血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)明显增高,高密度脂蛋白胆固醇水平(HDL-C)明显降低(P<0.05或P<0.01),重塑指数与总胆固醇(TC)、LDL-C呈正相关,而与HDL-C呈负相关,差异均有统计学意义(P<0.05)。代偿性扩张组炎性指标较高,出现偏心性软斑块的概率较高,无代偿性扩张组内皮素水平较高,更易出现斑块钙化。结论:血管重塑与脂代谢异常以及病变部位斑块性质密切相关。炎症反应和内皮功能紊乱引起的内皮素分泌失衡也可能是血管重塑的机制。

具有生物学活性的hMSH2蛋白在昆虫sf9细胞中的表达

目的表达具有生物活性的hMSH2蛋白。方法用搭桥PCR获得hMSH2全长基因,构建pAcGP67B-hMSH2重组质粒,与AcNPV昆虫病毒DNA共转染昆虫细胞sf9,表达hMSH2蛋白(同时构建pET30a-hMSH2重组质粒,用大肠杆菌表达hMSH2蛋白);Western blot鉴定hMSH2蛋白;ELISA,流式细胞仪检测蛋白与OT3肽及TCRγδ的结合特异性;检测细胞增殖(MTT法)和细胞因子分泌,观察重组蛋白体外活化γδT细胞的生物学功能。结果克隆到正确的hMSH2基因,并将其插入到表达载体pAcGP67B和pET30a中的正确位置。经Western blot鉴定获得了hMSH2蛋白。用昆虫病毒表达载体系统表达的hMSH2蛋白能与其探针肽OT3及TCRγδ特异性结合,并能在体外刺激γδ细胞增殖及分泌IFN-γ,其活性更优于原核表达的蛋白。结论成功利用昆虫病毒载体表达系统得到了比原核大肠杆菌表达系统更具生物活性的hMSH2蛋白。

神经元凋亡与神经免疫调节网络功能下调模式

目的探讨神经免疫调节网络功能下调模式。方法应用大鼠全基因芯片检测技术分析免疫大鼠下丘脑外侧区和杏仁核前区神经免疫调节功能相关神经元凋亡等的相关信号表达;应用数据库对差异基因功能树进行分析。结果实验组大鼠基因表达谱分析显示有632个差异基因,经功能树相关分析显示其中34个基因参与信号传导功能的已知功能基因,涵盖了已知凋亡信号和凋亡调节信号相关传导路。结论在LH和AA脑区存在以神经元凋亡方式实现神经免疫调节功能相关的网络功能下调模式。

免疫源性IL-1在神经免疫调节网络传入通路中的作用

目的阐明免疫活性细胞表达的功能信号IL-1在神经免疫调节网络信号传导过程中的作用。方法应用双向电泳分离联合基质辅助激光解析电离飞行时间-质谱技术,分析实验大鼠外周血清中神经免疫功能相关差异组分的氨基酸组成。结果 2D电泳在相对分子质量(Mr)约18000、PI约5.0位置观察到1个与IL-1物理性质相似的特异性差异表达点;MALDI质谱检测、肽质量指纹图谱分析在相关数据库检索结果中报告了18个来源的19个相关肽段序列,共247个氨基酸,但相关结果不能满足任何已知物质的氨基酸序列排序要求。结论实验否定了免疫活性细胞释放到血液中的IL 1参与神经免疫调节网络功能的可能;是否存在网络神经元多极换元换能后间接活化中枢脑区功能的可能,还有待进一步实验研究。

M2型巨噬细胞来源外泌体对乳腺癌细胞系4T1干性特征的影响

目的探讨M2型巨噬细胞来源的外泌体对乳腺癌细胞系4T1细胞肿瘤干性特征的影响。方法用超速离心法分离M2型巨噬细胞来源的外泌体;用透射电子显微镜、纳米粒子追踪技术,Westernblot等对其进行鉴定;然后以乳腺癌细胞系4T1为肿瘤模型,使用Dil染料标记M2型巨噬细胞来源的外泌体,通过免疫荧光技术观察其能否进入4T1细胞。此外,用流式细胞计量术、共培养体系和Transwell实验探究在M2型巨噬细胞来源的外泌体影响下的4T1细胞的干性特征。结果M2型巨噬细胞在体外被成功诱导,分离并鉴定了M2型巨噬细胞来源的外泌体。通过免疫荧光,看到Dil标记的外泌体可成功进入4T1细胞。M2型巨噬细胞来源的外泌体与4T1细胞共孵育后,可明显增强4T1细胞的迁移能力(P<0.001)和成球能力(P<0.05);外泌体抑制剂GW4869可明显抑制4T1细胞的成球能力(P<0.05)。同时,M2型巨噬细胞来源的外泌体可明显增加4T1细胞中CD44highCD24low细胞的比例(P<0.001)。结论M2型巨噬细胞来源的外泌体能够促进4T1肿瘤细胞的迁移和成球能力,并明显增加4T1细胞中肿瘤干细胞的比例。

血浆可溶性MICA/B水平与慢性HIV感染者疾病进展的相关性研究

目的探讨主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex,MHC)Ⅰ类分子链相关抗原A/B(MICA/B)与HIV感染及疾病进展的关系。方法选取2013年1月至2014年12月首都医科大学附属北京佑安医院未经抗病毒治疗(antiretroviral therapy,ART)的慢性HIV感染者60例,采用流式细胞术检测CD4+T细胞计数,酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测血浆中可溶性MICA/B(sMICA/B)水平,Spearman秩和检验分析sMICA/B水平与CD4+T细胞的计数和病毒载量(viral load,VL)的相关性。结果与健康对照组比较,HIV感染者血浆sMICA水平显著增高[(109.7±69.8)pg/ml比(32.0±17.1)pg/ml,P<0.001],血浆sMICB水平与健康对照组比较差异无统计学意义[(694.8±251.3)pg/ml比(535.6±191.0)pg/ml,P=0.050]。HIV感染者中,10 000拷贝/ml≤VL≤100 000拷贝/ml组血浆sMICA水平显著高于健康对照组、VL>100 000拷贝/ml组和VL<10 000拷贝/ml组(P<0.001,P=0.002,P=0.001),而VL>100 000拷贝/ml组血浆sMICB水平显著高于健康对照组(P=0.027)。此外,血浆sMICB水平与VL显著相关(r=0.384,P=0.003)。结论血浆中sMICA/B的水平与慢性HIV感染者病毒载量增加相关,可能成为预测HIV感染者疾病进展的标志。

补体介导Fcα/μ受体对人肾小球系膜细胞的杀伤

目的研究补体能否经由Fcα/μ受体(Fcα/μR)介导杀伤人肾小球系膜细胞。方法应用脂质体将带有Fcα/μRcDNA的质粒pcDNA3.1-Fcα/μR转染入人肾小球系膜细胞(NHMC),用Western blot检测Fcα/μR在NHMC细胞的表达,激光共聚焦显微术检测Fcα/μR在细胞膜的表达。用流式细胞术与激光共聚焦显微术检测所制备的IgM型免疫复合物(IgM-IC)与膜表达Fcα/μR的NHMC细胞的结合,用台盼蓝染色检测补体介导的细胞杀伤作用。结果成功制备了胞膜表达Fcα/μR的NHMC细胞,IgM与IgM-IC能经由Fcα/μR结合于NHMC细胞。在补体作用下,结合有IgM-IC的pcDNA3.1-Fcα/μR转染细胞死亡率显著高于对照组野生型细胞、空载质粒转染细胞及无IgM-IC结合的pcDNA3.1-Fcα/μR转染细胞(P<0.001)。结论胞膜表达Fcα/μR并结合有IgM-IC的人肾小球系膜细胞能为补体所杀伤。

干扰素-α1b增强人γδT细胞对Daudi细胞系的细胞毒活性及相关机制

目的探讨干扰素-α1b(IFN-α1b)对人γδT细胞体外杀伤肿瘤细胞的促进作用及其相关机制。方法用IFN-α1b预处理的Daudi细胞作为靶细胞;用IFN-α1b预处理的γδT细胞作为效应细胞;LDH法检测γδT细胞对Daudi细胞的细胞毒活性;ELISA检测效靶细胞混合上清中γδT细胞分泌的颗粒酶B和γ干扰素水平;流式细胞计量技术检测IFN-α1b预处理Daudi细胞表面Fas受体和应激蛋白配体ULBP3/ULBP4的表达,以及γδT细胞表面活化分子CD69和CD25的变化。结果IFN-α1b分别预处理Daudi细胞和γδT细胞都能显著增强γδT细胞对Daudi细胞的细胞毒活性(P<0.0001);IFN-α1b预处理的γδT细胞分泌颗粒酶B和γ干扰素的能力显著提高(P<0.05);IFN-α1b能上调Daudi细胞表面Fas受体和应激配体ULBP4的表达水平,而应激配体ULBP3的表达没有变化;IFN-α1b还能上调γδT细胞表面CD69的表达水平,而CD25的表达没有变化。结论IFN-α1b能通过不同的途径促进人γδT细胞对肿瘤细胞系Daudi细胞的体外细胞毒活性,两者的联用能增强γδT细胞的肿瘤治疗疗效。

乙莫克舍增强顺铂对肺癌细胞系A549的抑制作用

目的探讨化学药物顺铂与肉毒碱棕榈酰基转移酶1(CPT1)小分子抑制剂乙莫克舍(etomoxir)对肿瘤细胞增殖及迁移的影响。方法分别用顺铂(7.5μmol/L)、etomoxir(75μmol/L)及顺铂联用etomoxir处理人非小细胞肺癌细胞系A549 72 h,CCK8检测A549的增殖作用;Transwell细胞迁移实验检测A549的迁移能力;annexin V/PI检测A549细胞凋亡;用etomoxir和顺铂联合治疗,裸鼠皮下成瘤模型检测该种联合治疗方法对肿瘤生长的影响。结果顺铂联用etomoxir后,肿瘤细胞生长及迁移能力受到明显抑制(P<0.05),并且肿瘤细胞的凋亡有明显增加(P<0.05);另外顺铂联用etomoxir治疗后,小鼠肿瘤的生长受到明显抑制(P<0.05)。结论顺铂联用etomoxir可以降低肿瘤细胞增殖能力,增强肿瘤细胞凋亡,提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,进而抑制肿瘤在裸鼠体内的生长。

小鼠乳腺癌干细胞免疫相关分子表达和免疫浸润的分析

目的分析小鼠乳腺癌干细胞(BCSCs)中免疫相关分子的表达和肿瘤组织中免疫细胞的浸润。方法用成球培养的方法在体外富集小鼠乳腺癌细胞系4T1和4T07的肿瘤干细胞(CSCs);用实时定量PCR检测BCSCs中免疫检查点与抗原递呈相关基因的表达;用小鼠乳腺癌原位移植瘤模型和流式细胞测量术分别检测脾脏和肿瘤组织中各类免疫细胞的比例。结果用成球培养的方法可以成功富集小鼠乳腺癌干细胞4T1和4T07;与贴壁培养的肿瘤细胞相比,小鼠BCSCs中免疫检查点和抗原递呈相关基因的表达有明显差异(P<0.05)。体内的结果表明,与贴壁肿瘤细胞来源的肿瘤组织相比,肿瘤干细胞来源的肿瘤组织中浸润更多的CD4^(+)T和CD8^(+)T细胞(P<0.05),但是CD11b^(+)F4/80^(+)的巨噬细胞浸润更少(P<0.05)。结论小鼠BCSCs中免疫检查点与抗原递呈相关基因的表达有改变,且在体内可招募更多的T细胞到肿瘤组织中去。