冠状动脉血管重塑与脂代谢异常及斑块稳定性关系的初探

目的:以血管内超声法评价冠状动脉代偿性扩张与脂代谢异常及斑块性质之间的关系,并探讨血管重塑的可能机制。方法:将冠状动脉造影确定为单支局限性病变的56例患者,分为代偿性扩张组(30例)和无代偿性扩张组(26例)。对冠状动脉重塑指数和血脂成分做相关性分析,并对2组间血脂水平、超敏C反应蛋白(hs-CRP)、白介素(IL)-6、内皮素(ET)-1和不同斑块性质分布进行对比分析。结果:与无代偿性扩张组相比,代偿性扩张组患者血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)明显增高,高密度脂蛋白胆固醇水平(HDL-C)明显降低(P<0.05或P<0.01),重塑指数与总胆固醇(TC)、LDL-C呈正相关,而与HDL-C呈负相关,差异均有统计学意义(P<0.05)。代偿性扩张组炎性指标较高,出现偏心性软斑块的概率较高,无代偿性扩张组内皮素水平较高,更易出现斑块钙化。结论:血管重塑与脂代谢异常以及病变部位斑块性质密切相关。炎症反应和内皮功能紊乱引起的内皮素分泌失衡也可能是血管重塑的机制。

昆虫杆状病毒表达系统表达TCRγ9/δ2-Fc融合蛋白及其生物学功能的初步鉴定

目的建立昆虫杆状病毒表达系统表达TCRγ9/δ2-Fc融合蛋白技术平台并鉴定其表达产物的生物学功能。方法用搭桥PCR获得γ9Fc和δ2(OT3)Fc基因片段,构建成pBACp10ph-γ9/δ2(OT3)-Fc重组质粒,与AcNPV昆虫病毒DNA共转染昆虫sf9细胞,表达TCRγ9/δ2-Fc融合蛋白;Western blot鉴定TCRγ9/δ2-Fc蛋白表达位置;胞内流式细胞仪检测γ9Fc和δ2(OT3)Fc两基因表达效率;蛋白G亲和层析后,SDS-PAGE鉴定蛋白纯度;激光共聚焦扫描显微镜技术和生物传感器技术检测了TCRγ9/δ2-Fc蛋白与SKOV3细胞和MNS蛋白的结合特性。结果成功构建pBACp10ph-γ9/δ2(OT3)-Fc表达载体,经鉴定发现TCRγ9/δ2-Fc蛋白在sf9细胞内表达,但γ9Fc和δ2(OT3)Fc两基因的表达效率有较大差异。纯化得到一定纯度的TCRγ9/δ2-Fc蛋白,并且具有与SKOV3细胞和MNS蛋白结合的特性。结论成功建立昆虫杆状病毒表达系统表达TCRγ9/δ2-Fc融合蛋白的技术平台,表达产物TCRγ9/δ2-Fc可以在体外模拟TCRγδ识别抗原的特性。

神经元凋亡与神经免疫调节网络功能下调模式

目的探讨神经免疫调节网络功能下调模式。方法应用大鼠全基因芯片检测技术分析免疫大鼠下丘脑外侧区和杏仁核前区神经免疫调节功能相关神经元凋亡等的相关信号表达;应用数据库对差异基因功能树进行分析。结果实验组大鼠基因表达谱分析显示有632个差异基因,经功能树相关分析显示其中34个基因参与信号传导功能的已知功能基因,涵盖了已知凋亡信号和凋亡调节信号相关传导路。结论在LH和AA脑区存在以神经元凋亡方式实现神经免疫调节功能相关的网络功能下调模式。

免疫源性IL-1在神经免疫调节网络传入通路中的作用

目的阐明免疫活性细胞表达的功能信号IL-1在神经免疫调节网络信号传导过程中的作用。方法应用双向电泳分离联合基质辅助激光解析电离飞行时间-质谱技术,分析实验大鼠外周血清中神经免疫功能相关差异组分的氨基酸组成。结果 2D电泳在相对分子质量(Mr)约18000、PI约5.0位置观察到1个与IL-1物理性质相似的特异性差异表达点;MALDI质谱检测、肽质量指纹图谱分析在相关数据库检索结果中报告了18个来源的19个相关肽段序列,共247个氨基酸,但相关结果不能满足任何已知物质的氨基酸序列排序要求。结论实验否定了免疫活性细胞释放到血液中的IL 1参与神经免疫调节网络功能的可能;是否存在网络神经元多极换元换能后间接活化中枢脑区功能的可能,还有待进一步实验研究。

M2型巨噬细胞来源外泌体对乳腺癌细胞系4T1干性特征的影响

目的探讨M2型巨噬细胞来源的外泌体对乳腺癌细胞系4T1细胞肿瘤干性特征的影响。方法用超速离心法分离M2型巨噬细胞来源的外泌体;用透射电子显微镜、纳米粒子追踪技术,Westernblot等对其进行鉴定;然后以乳腺癌细胞系4T1为肿瘤模型,使用Dil染料标记M2型巨噬细胞来源的外泌体,通过免疫荧光技术观察其能否进入4T1细胞。此外,用流式细胞计量术、共培养体系和Transwell实验探究在M2型巨噬细胞来源的外泌体影响下的4T1细胞的干性特征。结果M2型巨噬细胞在体外被成功诱导,分离并鉴定了M2型巨噬细胞来源的外泌体。通过免疫荧光,看到Dil标记的外泌体可成功进入4T1细胞。M2型巨噬细胞来源的外泌体与4T1细胞共孵育后,可明显增强4T1细胞的迁移能力(P<0.001)和成球能力(P<0.05);外泌体抑制剂GW4869可明显抑制4T1细胞的成球能力(P<0.05)。同时,M2型巨噬细胞来源的外泌体可明显增加4T1细胞中CD44highCD24low细胞的比例(P<0.001)。结论M2型巨噬细胞来源的外泌体能够促进4T1肿瘤细胞的迁移和成球能力,并明显增加4T1细胞中肿瘤干细胞的比例。

血浆可溶性MICA/B水平与慢性HIV感染者疾病进展的相关性研究

目的探讨主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex,MHC)Ⅰ类分子链相关抗原A/B(MICA/B)与HIV感染及疾病进展的关系。方法选取2013年1月至2014年12月首都医科大学附属北京佑安医院未经抗病毒治疗(antiretroviral therapy,ART)的慢性HIV感染者60例,采用流式细胞术检测CD4+T细胞计数,酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测血浆中可溶性MICA/B(sMICA/B)水平,Spearman秩和检验分析sMICA/B水平与CD4+T细胞的计数和病毒载量(viral load,VL)的相关性。结果与健康对照组比较,HIV感染者血浆sMICA水平显著增高[(109.7±69.8)pg/ml比(32.0±17.1)pg/ml,P<0.001],血浆sMICB水平与健康对照组比较差异无统计学意义[(694.8±251.3)pg/ml比(535.6±191.0)pg/ml,P=0.050]。HIV感染者中,10 000拷贝/ml≤VL≤100 000拷贝/ml组血浆sMICA水平显著高于健康对照组、VL>100 000拷贝/ml组和VL<10 000拷贝/ml组(P<0.001,P=0.002,P=0.001),而VL>100 000拷贝/ml组血浆sMICB水平显著高于健康对照组(P=0.027)。此外,血浆sMICB水平与VL显著相关(r=0.384,P=0.003)。结论血浆中sMICA/B的水平与慢性HIV感染者病毒载量增加相关,可能成为预测HIV感染者疾病进展的标志。

补体介导Fcα/μ受体对人肾小球系膜细胞的杀伤

目的研究补体能否经由Fcα/μ受体(Fcα/μR)介导杀伤人肾小球系膜细胞。方法应用脂质体将带有Fcα/μRcDNA的质粒pcDNA3.1-Fcα/μR转染入人肾小球系膜细胞(NHMC),用Western blot检测Fcα/μR在NHMC细胞的表达,激光共聚焦显微术检测Fcα/μR在细胞膜的表达。用流式细胞术与激光共聚焦显微术检测所制备的IgM型免疫复合物(IgM-IC)与膜表达Fcα/μR的NHMC细胞的结合,用台盼蓝染色检测补体介导的细胞杀伤作用。结果成功制备了胞膜表达Fcα/μR的NHMC细胞,IgM与IgM-IC能经由Fcα/μR结合于NHMC细胞。在补体作用下,结合有IgM-IC的pcDNA3.1-Fcα/μR转染细胞死亡率显著高于对照组野生型细胞、空载质粒转染细胞及无IgM-IC结合的pcDNA3.1-Fcα/μR转染细胞(P<0.001)。结论胞膜表达Fcα/μR并结合有IgM-IC的人肾小球系膜细胞能为补体所杀伤。

TRIM22稳定过表达细胞系的构建及其抗流感病毒的功能

目的构建稳定表达TRIM22的HEK293T细胞系HEK293T-TRIM22,观察TRIM22蛋白在该细胞内的表达及对流感病毒复制的影响并初步探究其抑制机制。方法扩增TRIM22基因并与反转录病毒载体进行体外重组连接,经菌液PCR、测序确认后与反转录病毒骨架载体共转染进HEK293T细胞进行包装病毒。用包装的反转录病毒感染HEK293T细胞,感染24 h后用嘌呤霉素筛选稳定过表达TRIM22的细胞,筛选48 h后用Western blot检测TRIM22表达水平;用IAV-LUC病毒检测稳定过表达TRIM22的HEK293T对流感病毒的抑制作用;再用双分子荧光互补实验(Bi LC)检测与TRIM22相互作用的流感蛋白。结果经测序确认目的基因TRIM22成功克隆到载体p QC-XIP中。包装反转录病毒并感染HEK293T细胞,经过嘌呤霉素筛选后,稳定过表达TRIM22的HEK293T细胞中TRIM22的蛋白表达水平升高(P<0.05)。在稳定过表达TRIM22的细胞内流感病毒复制减弱(P<0.05)。Bi LC检测TRIM22与流感蛋白NP有相互作用。结论稳定过表达TRIM22的HEK293T细胞系构建成功,TRIM22与NP有相互作用并且抑制流感病毒复制。

乙莫克舍增强顺铂对肺癌细胞系A549的抑制作用

目的探讨化学药物顺铂与肉毒碱棕榈酰基转移酶1(CPT1)小分子抑制剂乙莫克舍(etomoxir)对肿瘤细胞增殖及迁移的影响。方法分别用顺铂(7.5μmol/L)、etomoxir(75μmol/L)及顺铂联用etomoxir处理人非小细胞肺癌细胞系A549 72 h,CCK8检测A549的增殖作用;Transwell细胞迁移实验检测A549的迁移能力;annexin V/PI检测A549细胞凋亡;用etomoxir和顺铂联合治疗,裸鼠皮下成瘤模型检测该种联合治疗方法对肿瘤生长的影响。结果顺铂联用etomoxir后,肿瘤细胞生长及迁移能力受到明显抑制(P<0.05),并且肿瘤细胞的凋亡有明显增加(P<0.05);另外顺铂联用etomoxir治疗后,小鼠肿瘤的生长受到明显抑制(P<0.05)。结论顺铂联用etomoxir可以降低肿瘤细胞增殖能力,增强肿瘤细胞凋亡,提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,进而抑制肿瘤在裸鼠体内的生长。

体外扩增γδT细胞的肿瘤组织趋向性

目的探查体外扩增的γδT细胞向结直肠癌细胞迁移的能力。方法采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMCs),并利用固相化抗T细胞受体(TCR)γδ抗体进行2周的体外扩增。对扩增的γδT细胞进行免疫荧光染色和流式细胞仪分析或流式细胞仪分选。采用Bioplex 200流体芯片系统分析细胞因子和趋化因子的表达。采用transwell小室进行趋化实验。结果体外扩增的γδT细胞主要表达CCR5和CXCR3 2种趋化因子受体。4种结直肠癌细胞系和10种结直肠癌肿瘤组织中存在CCR5和CXCR3配体的表达。体外扩增的γδT细胞在TCR激活的情况下可以大量产生Th1和Th2型细胞因子,进一步募集γδT细胞。特别是其产生的干扰素γ(IFN-γ)能够提高结直肠癌细胞CXCR3配体的表达量,从而进一步促进γδT细胞的趋近。结论本研究结果为γδT细胞过继免疫治疗结直肠癌提供了重要指征。

肿瘤微环境中乳酸对巨噬细胞表型极化和功能的影响

目的研究肿瘤微环境中乳酸对巨噬细胞表型极化和功能的影响。方法在Balb/c小鼠乳腺处接种乳腺癌细胞4T1,研磨肿瘤组织后测其乳酸浓度。以不同浓度乳酸处理RAW264.7巨噬细胞,用流式细胞术、RT-PCR和Western blot检测M1、M2型巨噬细胞的标志分子和NFκB P50/P65。蛋白芯片检测RAW细胞分泌的细胞因子。流式细胞术检测RAW细胞吞噬功能和抗原递呈功能。结果小鼠乳腺癌组织的乳酸浓度高于正常乳腺组织(P<0.05)。15 mmol/L浓度的乳酸可显著上调RAW细胞M2型标志分子的表达(P<0.05),下调M1标志分子的表达(P<0.05),使RAW细胞分泌的M1型细胞因子明显减少(P<0.05),同时使磷酸化NFκB P65降低(P<0.05)。乳酸对RAW细胞的吞噬功能没有明显的影响,但减弱其抗原递呈功能(P<0.05)。结论在乳酸的作用下,RAW巨噬细胞表型向M2型转变,抗原递呈功能减弱,NFκB参与调控乳酸对巨噬细胞的作用。提示肿瘤微环境中的乳酸对抗肿瘤免疫有较大影响。

人外周血γδ T细胞的可溶性anti-TCR γδ抗体扩增及其培养和保存的条件

目的:比较人外周血γδT细胞不同的制备方法,摸索适于临床应用的培养和保存条件。方法:分离人外周血单个核细胞,分别以固相化和可溶性anti-TCRγδ抗体进行刺激,以添加小牛血清或人AB血浆的RPMI1640培养液或AIM V无血清培养液进行培养,采用锥虫蓝染色法检测γδT细胞存活率,采用免疫荧光染色法考察γδT细胞的纯度和亚型,采用乳酸脱氢酶(lacate dehydrogenase,LDH)法检测γδT细胞对不同肿瘤细胞系的杀伤作用。结果:添加15%小牛血清和添加5%人AB血浆的RPMI1640培养液对γδT细胞的培养效果接近,均优于AIM V无血清培养液。可溶性抗体与固相化抗体扩增外周血γδT细胞的效果相似;可溶性抗体扩增的γδT细胞受体(Tcell receptor,TCR)库容完整,同时具有TCR Vδ1和Vδ2两种亚型;对肺癌、肝癌和卵巢癌细胞系均有体外杀伤活性。这些γδT细胞在含1%人AB血浆或0.25%人血白蛋白的生理盐水中、4℃条件下保存12h,细胞存活率仍达95%以上。结论:可溶性anti-TCRγδ抗体和含有人AB血浆的RPMI1640培养液可以用于人外周血γδT细胞的体外扩增,扩增得到的γδT细胞在含有血浆或白蛋白的生理盐水中稳定性较好。

特异性CDR3区取代型γδTCR转染细胞的构建及生物学功能鉴定

目的:建立特异性CDR3区取代型γδTCR转染细胞平台。方法:利用搭桥PCR的方法将已知的γδT细胞克隆DBS4.3特异性CDR3编码序列嵌入到γ9和δ2cDNA序列中,取代原有的CDR3区序列,获得的全长γ9和δ2链分别插入真核表达载体pREP7和pREP9中,共转染J.RT3-T3.5细胞,双压力抗生素筛选获得表达特异性γδTCR的转染细胞,通过ELISA和Re-altime PCR检测该转染细胞在接受抗原刺激后IL-2的分泌情况。结果:ELISA和Realtime PCR结果显示表达DBS4.3特异性γδTCR的转染细胞在DBS4.3特异性抗原仲丁胺和抗γδTCR抗体刺激作用下,活化分泌IL-2。结论:构建了特异性CDR3区取代型γδTCR转染细胞平台,为研究γδTCR识别抗原的机制奠定了基础。

具有生物学活性的hMSH2蛋白在昆虫sf9细胞中的表达

目的表达具有生物活性的hMSH2蛋白。方法用搭桥PCR获得hMSH2全长基因,构建pAcGP67B-hMSH2重组质粒,与AcNPV昆虫病毒DNA共转染昆虫细胞sf9,表达hMSH2蛋白(同时构建pET30a-hMSH2重组质粒,用大肠杆菌表达hMSH2蛋白);Western blot鉴定hMSH2蛋白;ELISA,流式细胞仪检测蛋白与OT3肽及TCRγδ的结合特异性;检测细胞增殖(MTT法)和细胞因子分泌,观察重组蛋白体外活化γδT细胞的生物学功能。结果克隆到正确的hMSH2基因,并将其插入到表达载体pAcGP67B和pET30a中的正确位置。经Western blot鉴定获得了hMSH2蛋白。用昆虫病毒表达载体系统表达的hMSH2蛋白能与其探针肽OT3及TCRγδ特异性结合,并能在体外刺激γδ细胞增殖及分泌IFN-γ,其活性更优于原核表达的蛋白。结论成功利用昆虫病毒载体表达系统得到了比原核大肠杆菌表达系统更具生物活性的hMSH2蛋白。

不同治疗剂量白细胞介素2对人外周血γδT细胞增殖和表型的影响

目的研究治疗剂量范围内白细胞介素2(IL-2)对T细胞的增殖作用,特别是对人外周血γδT细胞数量和功能亚群的影响。方法采用密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞,在不同浓度IL-2作用下培养2周,利用免疫荧光染色和流式细胞术分析培养前后不同淋巴细胞的表型和比例,采用台盼蓝染色和血球计数法进行细胞计数。结果Vδ1和Vδ2型γδT细胞的4个功能亚群中,CD27+细胞(包括CD27+CD45RA+和CD27+CD45RA-)可以表达淋巴组织归巢受体CCR7,CD27-细胞(包括CD27-CD45RA+和CD27-CD45RA-)不表达CCR7,具有分布于外周组织的潜能;各个γδT细胞的功能亚群均能表达活性相关受体,在丝裂原刺激下可以迅速产生不同水平的细胞毒作用相关效应分子。虽然高剂量IL-2对CD4 T细胞的增殖产生抑制作用,但对γδT的增殖反而有促进作用,增殖的γδT细胞以CD27-CD45RA-的效应细胞为主。结论治疗剂量范围内的IL-2具有刺激人外周血γδT细胞增殖的作用,在基于IL-2的抗肿瘤治疗中可能具有重要的生物学意义。

稳定表达人可溶性增殖诱导配体(sAPRIL)的CHO细胞株的建立及鉴定

目的:构建稳定表达人可溶性增殖诱导配体(soluble a proliferation-inducing ligand,sAPRIL)的CHO细胞株。方法:利用RT-PCR方法克隆出sAPRIL基因,构建表达该基因的慢病毒表达载体,与辅助质粒共转染HEK-293T细胞,以包装病毒颗粒。将病毒上清感染CHO细胞,获得稳定表达sAPRIL的细胞株。利用RT-PCR、Western blot及FACS等方法鉴定其表达。结果:成功克隆出人sAPRIL基因,RT-PCR、Western blot及FACS结果显示成功构建了稳定表达sAPRIL的CHO细胞株。结论:结论:成功获得了稳定表达sAPRIL的细胞株,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。

脑和脊髓动静脉畸形血管中蛋白质表达谱的差异

目的探讨脑和脊髓动静脉畸形(AVM)在分子水平的表达谱差异。方法提取人脑(bAVM)、脊髓(sAVM)、对照脑血管、对照脊髓血管全蛋白质,通过TMT标记高通量定量蛋白质组学技术检测各组中蛋白质表达水平。结果在bAVM、sAVM、对照脑血管、对照脊髓血管样本中,采用蛋白质组学方法共检测到3102个高可信度蛋白质,在bAVM和sAVM中分别有852个和205个蛋白质的表达水平与其对照组有显著改变。生物信息学分析显示,304个蛋白质仅在bAVM中显著高表达,这些蛋白质主要是线粒体相关蛋白质,主要富集于电子传递链及钙调节通路;97个蛋白质仅在sAVM中显著高表达,主要参与细胞外基质的组成。结论线粒体功能异常及钙调节失衡可能在bAVM畸形血管的病理生理过程中发挥重要作用,细胞外基质组成及其糖基化异常可能参与sAVM畸形血管的进程。

多种肿瘤相关自身抗体在非小细胞肺癌中的联合诊断价值

目的探讨肿瘤-睾丸抗原(NY-ESO-1)、肿瘤蛋白P53(P53)、细胞周期素依赖性蛋白激酶2(CDK2)、膜联蛋白A2(annexin A2)、胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白1(IMP1)、泛素1(ubiquilin1)以及磷酸甘油酸变位酶(PGAM1)共7种自身抗体在非小细胞肺癌(NSCLC)中独立及联合诊断的应用价值。方法应用Luminex BioPlex200检测48例NSCLC和45例健康对照血清中NY-ESO-1、P53、CDK2、annexin A2、IMP1、ubiquilin1及PGAM1的表达水平,并用受试者工作特征(ROC)曲线分析其诊断的准确性。结果 1)7种自身抗体在NSCLC中的表达均显著高于健康对照组(P<0.05);2)ROC分析显示,NY-ESO-1和P53的AUC均≥0.7,annexin A2的检测特异性为88.89%;3)7种自身抗体联合检测时,AUC为0.812,敏感性为68.75%,特异性为91.11%。结论 7种自身抗体在NSCLC的诊断中均有一定意义,特别是7指标联合检测可有效提高诊断的准确性。

肿瘤pH微环境通过激活β-catenin/TCF4增强人乳腺癌肿瘤细胞的干性

目的探讨酸性微环境对于乳腺癌肿瘤干细胞干性的影响及其作用机制。方法分别在pH 6.8和7.4的环境下,培养人乳腺癌细胞MDA-MB-231。用流式细胞术、PCR、Western blot、体外成球实验和细胞划痕实验分别检测肿瘤干细胞ALDHhigh细胞亚群的比率,干性基因SOX2、OCT4和Lin28b的表达,成球能力和肿瘤细胞迁移能力,同时检测相关信号通路的激活。结果酸性微环境通过激活β-catenin/TCF4信号通路提高MDA-MB-231的ALDHhigh细胞亚群的比例(P<0.05),上调干性相关基因的表达(P<0.01),增强体外成球能力(P<0.01)和迁移能力(P<0.05)。结论酸性微环境能够上调干细胞比例,维持肿瘤干细胞干性特征,增加乳腺癌肿瘤细胞迁移能力。

LIN28B调控miRNAs维持MCF-7肿瘤干细胞的干性特征

目的研究LIN28B对人乳腺癌细胞(MCF-7)肿瘤干细胞的干性状态维持的作用机制。方法在MCF-7细胞中瞬时过表达LIN28B,用q PCR和Western blot检测干性相关基因SOX2、NAONG、c-Myc和OCT4的表达;用流式细胞仪检测CD44high/CD24low细胞亚群的比例;利用体外成球培养检测肿瘤干细胞自我更新的能力,通过RNA第二代测序技术检测在LIN28B过表达后MCF-7细胞中miRNAs的表达差异,通过转染差异表达的miRNA,检测其对MCF-7细胞肿瘤干细胞比例和体外成球能力的影响。结果转染p-CMV6-LIN28B后能明显提高LIN28B的mRNA和蛋白水平(P<0.001);过表达LIN28B后MCF-7细胞中SOX2、NANOG和OCT4在RNA和蛋白水平表达都明显增高(P<0.05);CD44high/CD24low细胞比例由1.71%上升至11.60%(P<0.05);体外成球培养发现成球细胞数量明显增多(P<0.01);通过RNA测序发现有16个miRNAs在LIN28B过表达后差异表达倍数在2倍以上且P<0.05,LIN28B过表达后miR-92b-5p表达显著上调(P<0.01);转染miR-92b-5p mimic后MCF-7细胞的CD44high/CD24low细胞比例由1.14%上升至3.59%(P<0.05),体外成球能力明显增强(P<0.01)。结论 LIN28B能维持MCF-7肿瘤干细胞的干性状态,其作用机制可能是通过miRNAs的表达来实现的。