基于γδ T细胞识别的应激配体的肝癌分子标记物研究

目的本研究从γδT细胞识别的应激配体出发,探索肝癌细胞的分子标记物。方法流式细胞技术检测了3个人肝癌细胞系(HepG2、SMMC7721和Hep3B)和1个正常的人胚肝细胞系(ccc HEL-1)表面11种已知的γδT细胞识别的应激配体的表达情况。收集了9名肝癌患者和10个健康对照的外周血样品,流式细胞技术分析了患者和对照的γδT细胞及其亚型的比例,ELISA检测血浆中10种应激配体的质量浓度。结果 3种不同的肝癌细胞系应激配体的表达情况存在着差异,与正常胚肝细胞系相比,ULBP1、ULBP5、HSP60、HSP90和MSH2在3种肝癌细胞系表达都有上调;与正常对照相比,肝癌患者外周血的γδT细胞总比例显著升高,CD27^-γδT细胞升高,而外周血主要的Vδ2细胞比例显著降低;10种应激配体在血浆中的质量浓度差异很大,在血浆质量浓度较高的应激配体中,ULBP1、ULBP4和HSP90在肝癌患者血浆中较正常人升高,有统计学意义。结论γδT细胞识别的应激配体ULBP1和HSP90在肝癌细胞系表面上调表达,并且在肝癌患者血浆中的质量浓度显著升高,是肝癌比较可靠的分子标记物。

阵发性睡眠性血红蛋白尿症红细胞乙酰胆碱酯酶的研究

用化学方法测定了乙酰胆碱脂酶（ＡｃｈＥ）活性，阵发性睡眠性血红蛋白尿症（ＰＮＨ）红细胞远低于正常红细胞。为了进一步研究ＰＮＨＡｃｈＥ（—）的红细胞，采用Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ＭＢ结合ＡｃｈＥ单抗亲和层析法分离出ＰＮＨＡｃｈＥ（—）的红细胞。用间接免疫荧光流式细胞术检测，ＰＮＨ细胞ＡｃｈＥ低于正常，而ＰＮＨＡｃｈＥ（—）红细胞未能检出ＡｃｈＥ。３Ｈ－肌醇标记实验证明，正常红细胞膜区带４．１处有较高的放射活性，而ＰＮＨ红细胞极低，ＰＮＨＡｃｈＥ（—）红细胞完全无放射活性。用ＡｃｈＥ抗体做免疫印渍实验证明了ＡｃｈＥ存在区带４．１部位。ＤＭＰＣ诱导正常和ＰＮＨ红细胞，检测二者囊泡化的程度，发现ＰＮＨ病人红细胞远比正常人红细胞易于囊泡化。

IgE高亲和力受体β链基因的多态性与中国人哮喘易感性的研究

目的 探讨IgE高亲和力受体 β链基因 (FcεRI β)的多态性与中国人哮喘易感性的连锁关系。方法 用PCR/RFLP检测FcεRI β基因编码区E2 37G变异位点及非编码区的 2个多态性位点 ,对 32个哮喘家系共 192份样品以及 12 2例哮喘患儿进行分析。结果 (1)中国人在这 3个位点的等位基因频率与白种人及日本人明显不同。 (2 )哮喘家系样本显示 ,第 2内含子区多态位点的A等位片段与哮喘有显著相关性 (P <0 .0 5 ,OR =2 .0 39,95 %CI=1.15 0 - 3.6 16 ,P =0 .0 15 ) ;基因型影响血清总IgE水平的变化 (F =3.5 8,P =0 .0 2 9) ;A等位片段与高血清总IgE的相关性有显著性意义 (P <0 0 5 ,RR =1.36 1,95 %CI=1.0 2 8- 1.80 3,P =0 .0 38)。 (3)编码区E2 37G位点及另一个非编码区位点未获得有显著意义的结果。结论 本研究的两组样本中 ,未能获得足够证据证实FcεRI

RANTES基因启动子区多态性对其蛋白表达的影响

目的探讨调节正常T细胞表达和分泌活性因子(RANTES)基因启动子区单核苷酸多态性对其蛋白表达的影响。方法分别测定44例正常儿童、44例哮喘患儿血清中及45例哮喘患儿外周血单个核细胞(PBMC)体外培养上清中RANTES的含量,同时对45例哮喘患儿DNA样本进行RANTES基因型确定。结果哮喘患儿血清中RANTES的水平显著高于正常对照儿童(P<0.01)。未发现RANTES-403(G/A)、-28(C/G)两位点的不同基因型显著影响哮喘患儿血清RANTES蛋白的水平(P>0.05),但两位点的不同基因型哮喘患儿,其PBMC分泌的RANTES水平有所不同:-403GA及-403AA基因型个体低于-403GG纯合型(P=0.06),-28CG杂合型个体低于CC纯合型(P<0.05)。结论趋化因子RANTES在哮喘的发病中具有重要作用,RANTES基因启动子区单核甘酸多态性可能通过影响其基因的表达,进而影响蛋白的表达,最终影响哮喘的发病过程和严重程度。

RACE: cDNA末端快速扩增技术进展

ＲＡＣＥ：ｃＤＮＡ末端快速扩增技术进展明洪黄秉仁中国协和医科大学基础医学院中国医学科学院基础医学研究所国家分子生物学重点实验室北京１００００５基因表达水平和模式的变化驱动着生物体内主要的生物学过程。分离和克隆基因是研究基因结构、功能以及表达的基础。以...

药物诱导的小鼠红白血病细胞沿红系分化过程中基因表达的差异显示分析

应用mRNA差异显示技术分析了药物诱导MEL细胞沿红系分化过程中基因表达的改变。以六个锚定引物和六个随机引物共36种组合进行差异显示分析，得到67个差异片段。对部分片段进行克隆测序，获20个片段的序列，其中12个新的表达序列标签。以反向斑点杂交检测部分差异显示带的差异性，阳性率为27／39（69％）。

应用基因表达谱芯片研究人腹主动脉瘤细胞周期和细胞凋亡相关基因

目的 筛选腹主动脉瘤发生过程中与正常组织差异表达的细胞周期和细胞凋亡相关基因并作初步功能分析。 方法 应用Trizol一步法抽提 2块腹主动脉瘤壁及 2块正常主动脉组织总RNA后 ,OligotexmRNASpin Column操作法分离纯化组织mRNA ;经逆转录合成荧光分子 (Cy3/Cy5)标记cDNA探针 ,与微矩阵排列的含有 4 0 96种cDNA基因的表达谱芯片杂交 ,利用GenePixPro 3 0软件分析动脉瘤与正常组织中差异表达的基因 ,对所获得的基因进行分子生物信息学分析。 结果 腹主动脉瘤与正常组织间差异表达的细胞周期和细胞凋亡基因有 1 8条 ,占芯片基因总数的 0 44%。其中与细胞周期相关的基因 1 1条 ,与细胞凋亡相关的基因 7条。在动脉瘤组织中表达上调的基因 9条 ,平均Ratio值为 3 860 ,表达下调的 9条 ,平均Ratio值为 0 2 94。生物信息学分析显示 ,该 1 8条差异表达细胞周期和细胞凋亡基因与腹主动脉瘤中平滑肌细胞的生长和凋亡有关。 结论 腹主动脉瘤的发生、发展过程中存在多基因表达调控的改变 ,细胞周期和细胞凋亡基因与腹主动脉瘤中平滑肌细胞等的生长和凋亡有相关性 。

降落聚合酶链反应技术在低密度脂蛋白受体基因点突变研究中的应用

目的 建立降落 (TOUCHDOWN)聚合酶链反应 (PCR)方法 ,快速检测家族性高胆固醇血症患者低密度脂蛋白受体 (LDL R)基因点突变。方法 设计LDL R基因 2 1对引物 ,根据TOUCHDOWN原理设计包括启动子和 18个外显子特异性片段在内的PCR程序 ,通过试验选择PCR最佳反应条件 ,在同一程序中分别对 2 1个片段进行扩增 ,琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物 ,纯化后DNA产物测序分析该方法的特异性。结果 编设退火温度范围从 6 8℃降至 5 4℃的PCR程序 ,优化PCR扩增条件 ,电泳检测采用同一程序同时分别扩增的LDL R基因 2 1个片段条带清晰 ,测序证实了此组片段的特异性。结论 成功建立降落PCR方法 ,提示此法为LDL R基因突变筛查提供了快速可靠的手段。

小而密低密度脂蛋白对内皮细胞间黏附分子表达的影响

目的 探讨小而密低密度脂蛋白 (sLDL)致动脉粥样硬化 (AS)的可能机制。方法 两步超速离心法提取人sLDL作为试验组 ,与培养的人脐静脉内皮细胞共同孵育 12h。设置大而轻LDL、氧化sLDL、氧化大而轻LDL对照组。用酶联免疫吸附试验 (ELISA)测定各组孵育细胞内皮细胞细胞间黏附分子 1(ICAM 1)的蛋白表达。同时用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)检测孵育细胞ICAM 1基因表达 ,以磷酸甘油醛脱氢酶基因 (GAPDH)扩增产物作为内对照。结果 与其他对照组比较 ,sLDL显著诱导培养细胞的ICAM 1信使核糖核酸 (mRNA)和蛋白表达。结论 sLDL对内皮细胞功能的有较强的损伤作用 ,与AS的发生关系密切。

家族性高胆固醇血症患者低密度脂蛋白受体基因复合纯合突变一例

目的 检测家族性高胆固醇血症 (FH)患者低密度脂蛋白受体 (LDL R)基因点突变 ,分析基因型与临床表型间的关系 ,探讨其分子病理机制。方法 以 1例临床诊断为FH纯合子患儿及其父母的基因组DNA为模板 ,用降落PCR方法 ,在同一程序中分别对LDL R基因的启动子和全部 18个外显子片段进行扩增 ,琼脂糖凝胶电泳检测 ,扩增产物直接进行核苷酸序列分析 ,并检索FH突变数据库 (www ucl ac uk/fh)。此外采用PCR 限制性内切酶技术 ,检测载脂蛋白 (Apo)B10 0 基因Q35 0 0R突变 ,以排除家族性ApoB10 0 缺陷症。结果 该患儿及其父亲第 4外显子发生Cys12 2 →Tyr(C12 2Y)杂合错义突变 ,同时患儿及其母第 9外显子发生Thr3 83 →Ile(T383I)杂合错义突变 ,因此该患儿LDL R基因第 4、9外显子各存在一个杂合突变 ,上述突变尚未在FH突变数据库见到。未检测出患儿及其父母ApoB10 0 Q35 0 0R突变。结论 此患儿为LDL R基因存在C12 2Y、T383I复合纯合突变并分别来自其父母 ;以上两位点突变可引起FH ;是FH患者LDL R基因的一种新突变类型。

变性高效液相色谱技术在家族性高胆固醇血症低密度脂蛋白受体基因点突变检测中的应用

目的以变性高效液相色谱(DHPLC),分析检测家族性高胆固醇血症(FH)一汉族家系成员的低密度脂蛋白受体(LDLR)基因突变,以明确诊断。方法收集临床诊断为家族性高胆固醇血症的汉族一个家系共37名成员,其中30人为一级和二级亲属,7名为亲属配偶作为对照,提取基因组DNA,聚合酶链反应(PCR)方法扩增LDLR基因包含启动子和全部基因编码区(118外显子)及临近的内含子序列共21个片段,琼脂糖凝胶电泳鉴定产物。采用DHPLC技术检测了LDLR基因,对洗脱曲线异常者进行核苷酸序列分析。结果该家系中发现4处变异,其中1处经核苷酸序列测定明确了突变的性质为第3内含子的剪接突变,并在此家系5名成员中得到证实,而对照组中未检出。结论成功地建立了以DHPLC筛查LDLR基因点突变的方法及技术参数,该方法简便,结果稳定,可作为大样本筛查突变位点的一种便捷可靠手段。

断层皮片成纤维细胞原代培养法

目的 在人成纤维细胞的生物学特性观察研究中 ,进行成纤维细胞的原代培养 ,以获得足够量的成纤维细胞。方法 我们采用整形外科断层取皮技术 ,使用细胞刮刀 ,可相对简单获取有活力的成纤维细胞 ,并应用台盼蓝细胞活力染色排除法进行检测。结果 该方法简单、经济可获取足够量的成纤维细胞 ,使得短期内即可获得大量的传代细胞。 1cm× 2cm的断层皮片可达到的细胞的数量级 10 6 左右。结论 断层皮片成纤维细胞培养方法 ,较胰酶消化法和组织块贴壁法有明显的优越性 ,在进行成纤维细胞移植方面 ,值得加以推广和应用。