人干细胞实验动物嵌合体模型的研究进展

动物模型是疾病研究、发病机制、药物治疗的必要工具,目前一些困扰人类健康的重大疾病如艾滋病、乙型肝炎等因为还没有能反映人类疾病发病机理的理想动物模型。人干细胞是能在体外长期培养的、高度未分化的全能细胞系,亚全能细胞系和分化的干细胞等。如果能将人的干细胞成功移植入实验动物体内形成人源化嵌合体动物,有希望为艾滋病、肝炎等的研究制备适当的模型。人类干细胞在动物中的移植研究中主要的实验动物是绵羊,小鼠等,本文介绍了人干细胞在动物体内移植的研究进展。

SIVmac251不同途径感染恒河猴急性期实验研究

目的建立SIV黏膜感染的恒河猴模型,并与静脉感染相比较,研究不同途径感染后病程进展是否存在差异。方法用SIVmac251经静脉、阴道、直肠3种途径分别感染恒河猴,定期采血,进行全血病毒分离,测定血浆病毒载量、CD4+/CD8+比值及抗体检测。结果感染后7d至目前56d为止,外周血单核淋巴细胞中前病毒DNA检测、全血病毒分离全部呈现阳性,只有直肠感染猴S172在7d和42d时出现较高病毒滴度;血浆病毒载量检测阳性出现先后顺序为静脉感染、直肠感染、阴道感染,14d达到高峰,然后迅速下降,变化趋势基本保持一致。血浆抗体检测从第14天开始3种途径感染的恒河猴体内抗体均为阳性;感染后CD4+/CD8+比值下降,在第28天时出现比例倒置。结论经不同途径均成功感染恒河猴后在病毒分离和血浆病毒载量等方面表现出了一定的差异。

实验动物泰泽病原位杂交法的建立

目的 建立实验动物泰泽病原位杂交检测方法。方法 用已感染Tyzzer菌小鼠的 3T3细胞 (MT -3T3细胞 )感染 4周龄的ICR小鼠 ,以 4 .0× 10 5细胞量感染动物 ,动物于感染后 4～ 7d发病。根据Tyzzer菌 16srDNA序列设计出两对特异引物 ,以MT - 3T3细胞的DNA提取物为模板 ,进行套式PCR。扩增出Tyzzer菌特有的 196bp条带。以此产物为探针 ,用地高辛PCR一步法进行探针标记。选择感染动物的肝脏 ,采用不同探针浓度进行原位杂交。结果 当探针的最小浓度为 4 0ng μl时 ,在肝细胞的胞质中有阳性结果。 结论 原位杂交方法能直接定位Tyzzer菌的感染位置 ,本研究建立的方法简单 ,易于操作 ,便于普及。

中药“脱发再生灵”促毛发生长的实验研究

目的:观察中药“脱发再生灵”促毛发生长效果。方法:选用豚鼠50只,分为脱发再生灵高剂量组、中剂量组、低剂量组、生发酊组(阳性对照)、赋形剂组(阴性对照组)。连续涂抹21天,每天测量各组动物毛发长度。结果:(1)从给药第6天起,低剂量组与赋形剂组比较毛发增长的长度差异有显著性P<0.05;从给药第8天起,高、中、低剂量组及生发酊组均与赋形剂组比较,差异均有极显著性P<0.01,P<0.001并保持到实验末期。(2)脱发再生灵高、中、低剂量组与阴性组比较给药皮肤的毛囊数、毛细血管数、毛细血管管径及棘层细胞数量等均有显著性差异P<0.05,P<0.01,P<0.001。结论:脱发再生灵能扩张豚鼠真皮浅层毛细血管,增加局部供血量,改善局部微循环,加强毛囊营养,促进毛发生长和再生。

SIVp27抗原双抗体夹心ELISA检测方法的研究

目的建立检测SIVp27抗原的双抗体夹心ELISA方法并进行初步应用。方法使用ProteinA亲和层析柱纯化腹水中的SIVp27单抗,用过碘酸钠法对单抗进行辣根过氧化物酶标记。经抗体配对实验确定包被抗体和检测抗体,再用棋盘滴定法确定抗体工作浓度后,探索构建检测SIVp27抗原的双抗体夹心ELISA法。应用建立的双抗体夹心ELISA法,对SIV模型猴血浆标本和SHIV模型猴病毒分离培养上清标本进行了检测,并将其结果与Coulter公司试剂盒检测结果进行比较。结果以稀释至20ug/mL的2E12为包被抗体、1:400稀释的酶标3G3为检测抗体为ELISA最优体系。模型猴血浆标本和病毒分离培养上清标本的检测结果表明自建体系可以用于SIVp27抗原的检测,特异性良好,灵敏度略低于Coulter公司试剂盒。结论检测SIVp27抗原的双抗体夹心ELISA方法初步建成,为研制有独立知识产权的检测试剂奠定了一定的基础。

SARS-CoV对幼年和成年布氏田鼠的感染研究

采用鼻腔喷雾法(CCID50=105.7)研究了SARS冠状病毒(SARS-CoV)对成年和幼年布氏田鼠的感染效果.成年动物攻毒后出现死亡,表现为口鼻有出血,肠道出血;肺组织呈出血性间质性肺炎改变,肝、脾、肾、胰腺组织均呈淤血性改变;存活动物肺组织呈间质性肺炎,局灶出血及肺气肿改变,其他脏器未见明显病变.幼年动物攻毒后未见死亡但行动较为迟缓,主要脏器未见明显异常;早期肺组织有局限性肺炎改变,且病毒分离为阳性;同居对照组的一只动物有肺组织局灶性肺炎.结果表明,SARS-CoV可以很强地感染布氏田鼠;成年布氏田鼠比幼年动物对SARS-CoV更敏感;布氏田鼠有望成为一种比较理想的小型SARS动物模型。

荧光蛋白在肿瘤分子影像研究中的应用

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)是在水母中发现的新型报告分子,该蛋白及其衍生物能在多种生物体内表达并发出荧光,是目前在生物学中研究和开发应用得最广泛的蛋白质之一。尤其是在肿瘤的研究中,荧光蛋白的分子影像可为深入揭示肿瘤发生发展的病理过程的机制,以及对其治疗进行实时、动态、细致、无创、靶向性的探测和跟踪提供有效手段。

PCR技术在猴免疫缺陷病毒(SIV)感染模型中的应用

目的(1)建立RT PCR方法,定性测定SIV感染猴血浆中病毒RNA,比较其与传统血浆病毒分离方法的敏感性;(2)建立DNA PCR方法,检测SIV感染猴外周血淋巴细胞(PBMCs)中的前病毒DNA。(3)检验DNA PCR和RNA PCR方法在猴SAIDS模型应用中的实用性和可操作性。方法用SIVmac251静脉感染恒河猴,定期采血,从血浆中提取病毒RNA,以RNA为模板通过RT PCR法扩增,凝胶电泳定性;从感染猴PBMC中提取带有整合的SIV前病毒DNA的细胞基因组DNA,巢式PCR扩增,凝胶电泳定性。结果DNA PCR和RNA PCR经两轮扩增后均得到一长度为477bp的特异条带,测序鉴定确为目的片段。9只实验猴感染SIV后7d,RNA PCR结果为79阳性,DNA PCR结果为100%阳性,而血浆病毒分离只有59阳性;此后一直到感染后的42d,RNA PCR和DNA PCR的结果一直为100%阳性,而血浆病毒分离阳性率在感染后35d下降到49,到42d时下降为零。结论PCR方法比病毒分离方法的敏感性高。尤其是DNA PCR,既可检测具有活跃病毒复制的受感染细胞,又可检测那些携带病毒处于转录休眠期的细胞,所以在感染的早期和中后期———血浆病毒水平较低的情况下或病毒处于潜伏感染的阶段,它作为猴艾滋病(SAIDS)模型病毒学指标之一有其必要性和重要性。这个指标的检测方法应该是较血浆病毒RNA检测更为敏感。

SHIV病毒在猴体内的复制与传代

目的为建立SHIV艾滋病动物模型提供毒力较强的病毒株,将新合成的SHIV XJ02170病毒适应猴体,并增强其毒力。方法实验前采集猴血清并进行血清学检查和PCR检测。选出13只无SIV,STLV1,SRV D和B病毒感染的猴。第一批实验,将SHIV前病毒DNA质粒经肌肉注射到猴体内,每只500μg;SHIV病毒液,经静脉注射到猴体内,每只2ml。病毒质粒和病毒液各接种2只猴。当第一批猴体检出病毒后,10ml感染猴的全血,抗凝后静脉注射到第二批猴体内,当第二批猴检出病毒后再将10ml感染猴的全血静脉注射到第三批猴体内,连续传代4次。每批实验均定期采集血液标本,分别用肝素和EDTA抗凝,进行病毒分离;病毒基因PCR检测;CD4,CD8测定;病毒抗体检测。结果SHIV XJ02170病毒和SHIV XJ02170前病毒DNA质粒在猴体内的传代中均能分离出病毒;从传代猴的血浆和外周血单核细胞(PBMC)中检出了病毒DNA和RNA基因;CD4,CD8测定结果显示有暂时性倒置现象,后变为正常倒置与正常交替出现;在传代的猴血清中检测出特异性HIV病毒抗体。结论SHIV XJ02170病毒与SHIV XJ02170前病毒DNA质粒,均能在恒河猴体内复制。

猴副流感病毒SV5 PCR检测方法的建立与初步应用

目的建立检测SV5的PCR方法并加以初步应用。方法根据GenBank中报道的SV5序列,针对其中的SH基因设计引物进行PCR反应,扩增产物进行测序并用BLAST软件进行同源性比对,同时利用限制性内切酶的酶切反应以证实此PCR反应的特异性。在此基础上设计巢式PCR提高此方法的灵敏度。利用此方法对20份猴肾源细胞培养物和40份血清标本进行检测。结果利用设计的引物扩增出的序列测序结果证实与报道的SV5SH基因相对位置的序列一致。AccⅢ限制性内切酶可对PCR产物进行特异性酶切。巢式PCR比一次PCR的敏感度有所提高。用此方法检测的20份猴肾源细胞培养物和40份血清标本结果为阴性。结论初步建立了检测SV5病毒的PCR方法,排除实验室用20份猴肾源细胞培养物和40份血清标本SV5的污染。

清洁级Wistar大鼠标准指标

目的 :建立清洁级 Wistar大鼠的正常生理、血常规及生化指标。方法 :分别选取 6周龄、 12周龄、18周龄和 3 0周龄的清洁级 Wistar大鼠 ,雌雄各 2 0只。测量动物的主要生理指标 (生长曲线、体重回归方程、脏器系数和大、小肠长度 )、血常规及生化指示。结果 :雄性动物的体重增长趋势比雌性动物高 ;随着年龄的增长 ;脏器系数逐渐降低。相同年龄段动物的 WBC、GR%、AL T、AL P、L DL-CHOL雄性比雌性明显偏高 ( P<0 .0 1) ;而 TP、 AL B、 TRIG比雌性动物明显偏低 ( P<0 .0 1)

猴D型反转录病毒巢式PCR检测方法的建立

目的建立SRV-1巢式PCR检测方法并进行初步应用。方法针对SRV-1env基因的保守区序列,设计特异性引物,以感染SRV-1 Raji细胞提取出的含有前病毒DNA的基因组DNA为模板,进行巢式PCR反应。扩增产物测序后与GenBank报道的序列进行同源比对。将DNA样本进行10倍梯度稀释,以检测巢式PCR反应的灵敏度。使用该方法对正常Raji细胞以及感染SIV、STLV的外周血淋巴细胞DNA样本进行扩增,检测该方法的特异性。用建立的巢式PCR方法检测40份储存猴血标本。结果使用巢式PCR扩增出的特异片段经测序分析,结果证实与GenBank报道的序列一致。所建立的巢式PCR检测法检测限度可达1.5×10-3ng/μL,而且方法特异。用此方法检测40份猴血标本,未检测到阳性标本。结论初步建立SRV-1的巢式PCR检测方法,该方法灵敏、特异,为SRV-1的检测提供了一个快速、有效的手段。

人工培养小鼠Tyzzer's菌和PCR检测方法的建立

Tyzzer＇s菌为严格的细胞内寄生,无法在人工培养基上增殖,目前国内常使用的方法为鸡胚和实验动物活体传代。我们实验室成功地在小鼠3T3细胞上培养小鼠Tyzzer＇s菌（MT-3T3）用套式PCR方法扩增,扩增出Tyzzer＇s茵特有的196hp条带。目前MT-3T3细胞已经应用于分子生物学和分子病理学的研究。

SIVmac感染食蟹猴、恒河猴的外周血血象观察

目的 比较SIVmac感染的食蟹猴、恒河猴外周血粒系统变化情况。方法 常规方法进行白细胞 (WBC)和白细胞分类计数 (WBC .DC)。结果 感染了SIVmac的恒河猴、食蟹猴其外周血粒系统变化与人类AIDS外周血变化相似 ,显现规律性的白细胞数量、形态变化。感染SIVmac病毒两周后 ,恒河猴、食蟹猴的白细胞总数开始下降 ,异型淋巴细胞数开始上升 ,随后白细胞总数持续回升至高峰 ,8周后白细胞总数及异型淋巴细胞数下降 ,其中三只食蟹猴先后于 8周后死于病毒血症和早期死亡 ,余 1只猴白细胞总数于 12周后仍持续下降。结论 本文中描述的现象同人类HIV AIDS的诊断标准实验检查部分中提及的基本一致。另外 ,本实验还表明恒河猴、食蟹猴对SIVmac毒株的实验感染是敏感的 。

PCR技术在猴免疫缺陷病毒(SIV)感染模型中的应用

[目的](1)建立RT-PCR方法,定性测定SIV感染猴血浆中病毒RNA,比较其与传统血浆病毒分离方法的敏感性;(2)建立DNA-PCR方法,检测SIV感染猴外周血淋巴细胞(PBMCs)中的前病毒DNA。(3)检验DNA-PCR和RNA-PCR方法在猴SAIDS模型应用中的实用性和可操作性。[方法]用SIVmac251静脉感染恒河猴,定期采血,从血浆中提取病毒RNA,以RNA为模板通过RT-PCR法扩增,凝胶电泳定性;从感染猴PB-MC中提取带有整合的SIV前病毒DNA的细胞基因组DNA,巢式PCR扩增,凝胶电泳定性。[结果]DNA-PCR和RNA-PCR经两轮扩增后均得到一长度为477bp的特异条带,测序鉴定确为目的片段。9只实验猴感染SIV后7天,RNA-PCR结果为7/9阳性,DNA-PCR结果为100%阳性,而血浆病毒分离只有5/9阳性;此后一直到感染后的42天,RNA-PCR和DNA-PCR的结果一直为100%阳性,而血浆病毒分离阳性率在感染后35天下降到4/9,到42天时下降为零。[结论]PCR方法比病毒分离方法的敏感性高。尤其是DNA-PCR,既可检测具有活跃病毒复制的受感染细胞,又可检测那些携带病毒处于转录休眠期的细胞,所以在感染的早期和中后期——血浆病毒水平较低的情况下或病毒处于潜伏感染的阶段,它作为猴艾滋病(SAIDS)模型病毒学指标之一有其必要性和重要性。这个指标的检测方法应该是较血浆病毒RNA检测更为敏感。

猴副流感病毒SV5的PCR检测方法建立及初步应用

[目的]建立检测SV5的PCR方法并加以初步应用。[方法]根据Genbank中报道的SV5序列,针对其中的SH基因设计引物进行PCR反应,扩增产物进行测序并用BLAST软件进行同源性比对,同时利用限制性内切酶的酶切反应以证实此PCR反应的特异性。在此基础上设计巢式PCR提高此方法的灵敏度。利用此方法对20份猴肾源细胞培养物和40份血清标本进行检测。[结果]利用设计的引物扩增出的序列测序结果证实与报道的SV5SH基因相对位置的序列一致。AccIII限制性内切酶可对PCR产物进行特异性酶切。巢式PCR比一次PCR的敏感度有所提高。用此方法检测的20份猴肾源细胞培养物和40份血清标本结果为阴性。[结论]本文首次初步建立了检测SV5病毒的PCR方法,排除实验室用20份猴肾源细胞培养物和40份血清标本SV5的污染。

SIVp27单克隆抗体的制备和鉴定

[目的]建立SIVp27杂交瘤细胞株,并对其分泌的SIVp27单克隆抗体进行初步鉴定。[方法]使用基因重组的SIVp27蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术使用半固体培养基法建立杂交瘤细胞株,制备单克隆抗体。通过染色体核型对杂交瘤细胞株进行鉴定;采用Westernblot、免疫荧光法、酶联免疫吸附法确定单克隆抗体的交叉反应性、相对亲和力、抗原识别表位、免疫球蛋白的类型和亚类,对单克隆抗体进行鉴定。[结果]获得四株可稳定分泌SIVp27单克隆抗体的杂交瘤细胞,1C3、2B6为IgG1类,2E12为IgG2b类,3G3为IgG2a类。四株单抗均能识别SIV的p27蛋白,与逆转录病毒SRV、STLV无交叉反应,2B6、2E12与HIVp24有交叉反应。免疫荧光法检测腹水效价为1:10240~40960。1C3、2B6、2E12、3G3染色体平均数分别为103、97、96、101。2E12与3G3识别不同的抗原表位。[结论]成功地制备出四株SIVp27单克隆抗体,均具有良好的特异性和亲和力,为进一步建立免疫分析方法,进行SIV/SAIDS及其艾滋病相关研究,奠定了基础。

长链非编码RNANRAV在抗病毒应答中对干扰素刺激基因(ISG)转录的调控作用

天然免疫是宿主抵抗病毒的第一道防线。病毒侵染宿主后，宿主的病原识别受体（PRR）鉴别出病毒的核酸或蛋门质组分，激活抗病毒天然免疫应答。一系列天然免疫信号通路被PRR激活，通路下游的转录因子随之活化并进入细胞核，核内各种免疫相关基因依次开始转录调控。首先，干扰素大量表达并被分泌至细胞外，随后上百种干扰素刺激基因（ISG）转录表达。

小鼠遗传图谱的应用与前景

仅在４年的时间里先进技术已使小鼠遗传图谱的平均间隔由４．３ｃＭ提高到０．２ｃＭ。小鼠遗传图谱的发展对研究哺乳动物基因组的进化，建立人类疾病的动物模型等起到巨大的推动作用。

重组人干扰素α-2b鼻腔喷雾剂预防治疗恒河猴感染SARS-CoV的试验研究

目的评价重组人干扰素α-2b鼻腔喷雾剂对恒河猴感染SARS-CoV的预防治疗作用。方法采用鼻腔喷雾法(剂量为60万单位/鼻孔)研究了重组人干扰素α-2b鼻腔喷雾剂对感染SARS-CoV的恒河猴预防治疗效果。结果试验组(5只)和对照组(5只)相同时间检测的咽拭子等标本中,Real-time PCR检测和病毒分离均未检出病毒。攻毒后病毒导致机体产生的中和抗体和IgG抗体的反应也较对照组弱。血液学指标检测结果表明试验组动物攻毒后各项指标较试验前比较没有显著性改变;病理结果显示试验组2只恒河猴肺组织形态基本正常,其余3只猴有肺间质性炎,表现肺间隔增厚、单核样细胞为主的炎细胞浸润,其中1只增厚的肺间隔有局灶相互融合,这3只猴肺部病变与对照组的病变表现相似,且病变累及范围较对照组小;其他各受检脏器均未见明显异常。结论重组人干扰素α-2b鼻腔喷雾剂可以有效阻断或减弱SARS-CoV对恒河猴的感染。