Wnt信号通路与自身免疫调节因子共同参与胚胎干细胞向胸腺上皮祖细胞的分化

背景:自身免疫调节因子(autoimmune regulator gene,Aire)及Wnt信号通路在小鼠胚胎干细胞多能性的维持及分化中都发挥着重要作用,但Wnt信号与Aire是否参与了小鼠胚胎干细胞向胸腺上皮祖细胞的分化尚未可知。目的:探讨Wnt信号通路和自身免疫调节因子与胚胎干细胞分化的关系。方法:采用两步分化方法定向诱导小鼠胚胎干细胞分化为内胚层再分化为胸腺上皮祖细胞,然后用Aire shRNA慢病毒感染小鼠胚胎干细胞,嘌呤霉素筛选单克隆稳定株,再采用两步分化方法进行诱导分化,分别于定向诱导分化第0,3,10天,采用细胞免疫荧光、流式细胞术、Western blot、Real-Time qPCR检测相关基因及蛋白的表达变化。结果与结论:①定向诱导分化第0天,免疫荧光染色显示SSEA1、OCT4表达呈阳性;②定向诱导分化第3天,免疫荧光染色显示SOX17、FOXA2表达呈双阳性;③定向诱导分化第10天,流式细胞术结果显示EPCAM1、K5、K8表达呈阳性;④与未分化的小鼠胚胎干细胞相比,诱导分化的胸腺上皮祖细胞中Wnt7a、β-catenin、Gsk-3β蛋白表达升高,Aire蛋白表达降低;⑤与未分化的小鼠胚胎干细胞相比,诱导分化的胸腺上皮祖细胞中Wnt7a、β-catenin、Gsk-3β及Aire mRNA表达升高;⑥与正常培养的小鼠胚胎干细胞及其最终分化的胸腺上皮祖细胞相比,敲低Aire基因的小鼠胚胎干细胞及其最终分化的胸腺上皮祖细胞中Wnt7a、β-catenin、Gsk-3β蛋白表达水平降低。综上所述,Wnt信号通路和Aire共同参与了小鼠胚胎干细胞定向诱导分化为小鼠胸腺上皮祖细胞的过程。

重点实验室在创新型医学本科人才培养中的实践

结合贵州医科大学组织工程与干细胞实验中心向本科生开放的模式,从高校重点实验室向本科生开放的基础、必要性,对培养学生实践能力和创新思维的意义,开放的方式以及取得的成效等方面探讨高校重点实验室向本科生开放在培养应用创新型医学人才中的作用。

多发性骨髓瘤细胞条件培养液对人脐带间充质干细胞增殖和分化的影响

背景:近年来,在肿瘤微环境中干细胞与肿瘤的相互作用已成为研究热点,但是多发性骨髓瘤细胞条件培养液对人脐带间充质干细胞影响的实验鲜有报道。目的:探讨多发性骨髓瘤细胞条件培养液对人脐带间充质干细胞增殖、迁移及分化能力的影响。方法:以组织块贴壁法提取人脐带间充质干细胞,同时培养并提取人多发性骨髓瘤RPMI8226和U266细胞上清液制备条件培养液。按培养基的不同进行细胞分组:对照组人脐带间充质干细胞仅用L-DMEM完全培养液培养;实验组人脐带间充质干细胞用20%RPMI8226细胞条件培养液或20%U266细胞条件培养液和80%L-DMEM完全培养液培养。培养24 h,通过CCK-8、EDU、结晶紫染色观察细胞增殖情况,划痕法评估细胞迁移情况,成骨成脂诱导实验检测细胞分化能力,Real-time PCR检测细胞中周期蛋白基因p16、p21 mRNA表达。结果与结论:实验组细胞的增殖数量多于对照组(P <0.05),迁移率高于对照组(P <0.05),矿化结节染色面积小于对照组(P <0.05),脂滴阳性染色面积大于对照组(P <0.05);实验组的细胞周期基因p16、p21 mRNA表达低于对照组(P <0.05)。结果表明,人多发性骨髓瘤细胞条件培养液可促进人脐带间充质干细胞的增殖、迁移和成脂分化,抑制成骨分化,可能与其抑制p16、p21基因表达有关。

红细胞膜相关蛋白通过IL-6/STAT3/ROR-γt信号通路抑制小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎中Th17细胞分化

目的探讨小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型中,外源性和内源性红细胞膜相关蛋白(ERMAP)通过白细胞介素6/信号转录及转录激活因子3(IL-6/STAT3)/维甲酸相关孤核受体γt/(ROR-γt)信号通路对辅助性T细胞17(Th17)细胞分化的影响。方法流式细胞术验证不同浓度ERMAP-Ig融合蛋白功能;琼脂糖凝胶电泳鉴定ERMAP基因敲除小鼠。流式细胞术检测ERMAP-Ig融合蛋白在体外对Th17细胞分化影响。40只6周龄普通C57BL/6小鼠随机分为2组建立EAE模型:对照(control)-Ig和ERMAP-Ig组,每组20只;记录临床评分;流式细胞术检测EAE小鼠体内Th17细胞分化情况。40只6周龄已鉴定的野生型和ERMAP基因敲除小鼠分为2组建立EAE模型:ERMAP^(+/+)和ERMAP^(-/-)组,每组20只。记录临床评分;脊髓HE和固蓝(LFB)染色并进行组织学半定量评分。流式细胞术检测IL-17A+CD4+T细胞百分比;Western blotting检测IL-6、白细胞介素17(IL-17)、STAT3、磷酸化STAT3(p-STAT3)、ROR-γt蛋白水平表达;Real-time PCR检测IL-17、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-6、STAT3和ROR-γt的mRNA表达;ELISA检测细胞水平IL-17和TNF-α的表达。结果1.外源性ERMAP-Ig融合蛋白抑制体内外Th17细胞分化且减轻小鼠EAE症状。2.与对照组相比,ERMAP^(-/-)组EAE小鼠炎性浸润和脱髓鞘症状加重,Th17分泌IL-17A增加。3.内源性ERMAP基因敲除后,IL-17、TNF-α、IL-6、STAT3及ROR-γt表达均增加。差异均有统计学意义(P<0.05)。结论ERMAP可能通过IL-6/STAT3/ROR-γt信号通路调控Th17细胞分化,参与小鼠EAE发生发展。

骨髓间充质干细胞对衰老猕猴胸腺及脾脏结构和功能的影响

背景:随着年龄的增长,脾脏的结构和功能发生改变,胸腺在青春期之后逐渐萎缩退化,导致机体发生免疫功能障碍。目的:探讨骨髓间充质干细胞对衰老猕猴胸腺及脾脏结构和功能的作用。方法:筛选出平均年龄25岁老年猕猴6只,随机分为老年组和老年治疗组各3只;老年治疗组猕猴经股静脉输注超顺磁性铁纳米颗粒标记的第4代骨髓间充质干细胞(1×10^(7)个/kg),1次/d,连续输注3 d,老年组猕猴在同一时间输注等体积的生理盐水;猕猴最后一次输注骨髓间充质干细胞5个月后给予安乐死处理,取出胸腺以及脾脏组织;苏木精-伊红染色观察胸腺组织和脾脏组织的结构变化;免疫荧光染色分析胸腺组织中各种T细胞亚群以及衰老相关基因蛋白P21的表达量变化;免疫组织化学染色分析脾脏组织中各种T细胞亚群以及衰老相关基因蛋白P21的表达量变化;安乐死处理猕猴之前抽取各组猕猴股静脉血5 mL,运用酶联免疫分析外周血血清中衰老相关分泌表型肿瘤坏死因子α和白细胞介素1α的分泌水平。结果与结论:①超顺磁性铁纳米颗粒标记的骨髓间充质干细胞经过股静脉输注入猕猴体内能够成功定植在衰老胸腺和脾脏组织中发挥作用;②骨髓间充质干细胞移植治疗后,衰老猕猴中胸腺部分组织出现清晰的皮质与髓质交界,脂肪细胞减少,出现胸腺小体,向正常的胸腺组织结构转变;衰老猕猴中脾脏组织出现清晰的红髓与白髓分界,脾小体的边缘多完整,且巨噬细胞减少,向正常的脾脏组织结构转变;③与老年组相比,老年治疗组衰老胸腺和脾脏组织中CD3^(+)、CD4^(+)以及CD8^(+)T细胞的表达量呈现增高的趋势,老年治疗组衰老胸腺和脾脏组织中P21蛋白的表达量呈现显著下降趋势;④与老年组相比,老年治疗组外周血中衰老相关分泌表型肿瘤坏死因子α以及白细胞介素1α的分泌水平呈现显著下降趋势;⑤上述结果表明,通过骨髓间充质干细胞的移植治疗,能够改善老年猕猴胸腺及脾脏组织的结构和功能。

人脐带间充质干细胞对T细胞活化介导的肺动脉平滑肌细胞增殖抑制及机制研究

目的阐释人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hu-MSCs)抑制T淋巴细胞活化介导的肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)增殖的作用及可能的调节机制。方法复苏并培养hu-MSCs和大鼠来源的PASMCs、T细胞,将实验分为PASMCs对照组、T细胞刺激组(PASMCs+T淋巴细胞)、MSC干预组(PASMCs+T淋巴细胞+MSC)、英夫利西单抗干预组(PASMCs+T淋巴细胞+英夫利西单抗)、TNF-α刺激组(PASMCs+T淋巴细胞+MSC+TNF-α)。通过荧光分光光度计、RT-qPCR、倒置荧光显微镜观察等方法研究钙调磷酸酶、T淋巴细胞核因子的变化。结果 T淋巴细胞刺激组TNF-α浓度明显升高(P<0.01);MSCs与英夫利西单抗均能明显降低其TNF-α浓度(P<0.01)。与单纯PASMCs对照组比较,T淋巴细胞刺激组PASMCs的增殖能力明显增强(P<0.01),胞浆中游离钙离子的浓度明显升高(P<0.01),胞内CaN的表达(P<0.01)和活性(P<0.01)均显著上调,NFATc2的表达和活性亦显著上调(P<0.01);与T淋巴细胞刺激组相比,MSCs干预组、英夫利西单抗干预组PASMCs的增殖被明显抑制(P<0.01),胞浆中游离钙离子的浓度均明显下降(P<0.01),胞内CaN的表达(P<0.01)和活性(P<0.01)均显著下调,NFATc2的表达(P<0.01)和活性亦下调;外源TNF-α可有效逆转MSC的干预作用,其作用与T淋巴细胞刺激组几乎相当。结论 hu-MSCs可以通过改变CaN、NFATc2的表达和活化状态,抑制T淋巴细胞活化,抑制炎症因子TNF-α导致的PASMCs增殖。

间充质干细胞治疗神经系统疾病的研究进展

目前许多神经系统疾病如缺氧缺血性脑病、恶性脑胶质瘤、神经退行性疾病包括阿尔茨海默病、帕金森病等仍无有效治疗方法或即使能够控制症状仍难以彻底治愈,预后较差,致残率高,严重影响个人生活品质和家庭幸福,并给家庭、社会造成极大的负担。近年来随着干细胞研究越来越深人。

甲基结合蛋白1对小鼠胚胎干细胞增殖及克隆形态的影响

目的:研究甲基结合蛋白1(Mbd1)对小鼠胚胎干细胞克隆形态及增殖的影响。方法:设计针对Mbd1转录起始位点的gRNA,将表达有gRNA和Cas9蛋白的质粒使用脂质体转染方法转入小鼠胚胎干细胞(J1);使用抗生素将未转染成功的细胞杀死后,细胞继续培养7d,挑取单克隆细胞,采用PCR法筛选敲除Mbd1的纯合子细胞,观察Mbd1缺失对小鼠胚胎干细胞克隆形态的影响;使用细胞计数法检验Mbd1对胚胎干细胞增殖的影响。结果:通过Cripsr/Cas9成功获得敲除Mbd1的胚胎干细胞,Mbd1缺失后的小鼠胚胎干细胞丧失了常规小鼠胚胎干细胞的3D克隆形态,细胞呈现单层扁平克隆;Mbd1缺失后小鼠胚胎干细胞增殖速率变慢。结论:Mbd1通过影响小鼠胚胎干细胞克隆形态和增殖而影响胚胎干细胞的多能性。

Tau蛋白通过外泌体传递到细胞外空间的研究

目的:验证HEK293-Tau细胞的外泌体中是否存在Tau蛋白、及Tau蛋白是否能够在细胞间通过外泌体传播。方法:通过经典的超速离心结合超滤法分离HEK293-Tau细胞的外泌体,通过透射电镜分析外泌体形态、采用Western blot鉴定外泌体特异性标记物(HSP70、CD63及CD9)及外泌体和细胞培养液中Tau蛋白表达。结果:超速离心结合超滤法成功地分离了HEK293-Tau细胞的外泌体,在透射电镜下观察到外泌体呈现典型的杯状形态,分离的外泌体中检测到HSP70、CD63及CD9等外泌体特异性标记物的表达;在外泌体及细胞培养液中能够检测到Tau蛋白的存在。结论: HEK293-Tau 细胞外泌体中存在Tau蛋白,并且Tau蛋白可以通过外泌体传递到细胞外空间。

急性淋巴细胞白血病患儿细胞因子水平与疾病状态的关系研究

目的观察急性淋巴细胞白血病患儿细胞因子水平与疾病状态的关系。方法选取2018年1月至2019年12月贵阳市妇幼保健院收治的212例急性淋巴细胞白血病患儿纳入急性淋巴细胞白血病组,根据患儿不同疾病状态将其分为初诊组(128例)、缓解组(84例),并将同期在该院常规体检的200例健康儿童纳入对照组,同期收治的50例急性髓细胞白血病患儿纳入急性髓细胞白血病组,对比各组血清白细胞介素(IL)-2、IL-10、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞计数(WBC)水平,并分析初诊急性淋巴细胞白血病患儿血清IL-2、IL-10、TNF-α、WBC水平与临床特征的相关性。随访6个月,根据急性淋巴细胞白血病患儿有无复发分为复发组(72例)与未复发组(140例),比较各组细胞因子水平。结果急性淋巴细胞白血病组TNF-α、IL-10、WBC水平高于急性髓细胞白血病组与对照组,IL-2水平低于急性髓细胞白血病组与对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。初诊组IL-2水平明显低于缓解组,TNF-α、IL-10、WBC水平高于缓解组,差异有统计学意义(P<0.05)。初诊急性淋巴细胞白血病患儿血清IL-2、IL-10、TNF-α、WBC水平与患儿年龄、性别及肝大等无关(P>0.05),与患儿疾病危险程度分型有关(P<0.05)。与未复发组相比,复发组血清IL-2水平降低,IL-10、WBC、TNF-α水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论急性淋巴细胞白血病患儿血清IL-2水平降低,TNF-α、IL-10、WBC水平升高,以上指标水平变化能够反映出患儿免疫功能好坏,可作为疾病状态及预后的评估指标,判断患儿疾病复发风险。

苗药宽叶腹水草对CCl_(4)致肝纤维化小鼠的治疗作用及其机制研究

目的:研究苗药宽叶腹水草对CCl_(4)所诱导肝纤维化小鼠的治疗作用及可能机制。方法:将60只SPF级昆明小鼠随机分为正常对照组、模型组、秋水仙碱(0.2 mg/kg)组及宽叶腹水草水提物低(200 mg/kg)、中(400 mg/kg)、高(800 mg/kg)剂量组,每组10只。除正常对照组外,其余各组小鼠均皮下注射CCl_(4)(CCl_(4)与橄榄油溶液1∶1混合)诱导肝纤维化,2次/w,连续8 w。从造模第5周开始,正常对照组和模型组小鼠灌胃生理盐水,其余各组小鼠均灌胃相应药物治疗,1次/d,连续4 w。末次给药处死所有小鼠后,收集肝脏,计算肝脏指数,HE及Masson染色观察肝组织病理学变化;全自动生化仪检测肝功能指标ALT、AST、ALP、ALB、TP水平;ELISA法检测纤维化指标PCⅢ、ColⅣ、LN、HA及炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平;试剂盒检测小鼠血清SOD、GSH-Px、MDA水平;Western Blot检测肝组织中α-SMA、TGF-β、Smad2、Smad3蛋白表达。结果:宽叶腹水草能显著升高CCl_(4)诱导肝纤维化小鼠体质量,降低肝脏指数,减少肝组织炎症浸润及胶原沉积,显著升高血清ALB、TP、SOD、GSH-Px水平,显著降低血清ALT、AST、ALP、PCⅢ、ColⅣ、LN、HA、TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA水平及肝组织中TGF-β、α-SMA、Smad2、Smad3蛋白表达。结论:宽叶腹水草对CCl_(4)诱导肝纤维化小鼠具有治疗作用,其机制可能与抑制TGF-β/Smad2/3信号通路、炎症反应及氧化应激有关。

RPL15在K562细胞向红系分化过程中的功能和机制研究

目的研究RPL15基因在K562细胞向红系诱导分化过程中的表达变化,并确定其对珠蛋白表达及红系分化的影响。方法用氯化血红素诱导K562细胞向红系分化,采用实时荧光定量PCR(q PCR)及Western blot法检测RPL15在K562红系分化过程中的表达情况。利用RNA干扰(RNAi)技术抑制K562细胞中RPL15的表达,进而通过四甲基联苯胺染色、q PCR及流式细胞技术检测K562细胞中血红蛋白、红系分化相关基因以及CD235a和CD71表达的变化。结果在K562细胞向红系分化过程中,RPL15的m RNA及蛋白水平均呈先升高后下降趋势。与对照组相比,干扰RPL15表达后,向红系分化24、48和72 h的K562细胞血红蛋白染色阳性率均明显下降;向红系分化的K562细胞中α-、β-、ε-、γ-珠蛋白及红系分化相关基因GATA1和HSP70相对表达量均明显下调(均P<0.05);而抑癌基因P53的m RNA表达水平显著上调(P<0.01)。同时CD235a^(+)CD71^(+)K562细胞比例在RPL15干扰后显著降低(P<0.01)。结论抑制RPL15表达可抑制K562细胞向红系分化,提示RPL15正调控红系分化过程。同时P53相关通路、GATA1及HSP70可能参与了RPL15对红系分化的调控过程。

基于高分辨率熔解曲线技术的CRISPR/Cas9介导的细胞基因突变快速检测研究

旨在建立一种通过高分辨率熔解曲线(high-resolution melting,HRM)分析技术快速检测CRISPR/Cas9介导的细胞基因突变的方法。采用野生型、纯合突变及杂合突变小鼠胚胎干细胞优化和完善HRM检测条件,然后应用建立的HRM方法对30个测序结果已知的CRISPR/Cas9技术编辑过的小鼠胚胎干细胞单克隆进行检测,根据熔解温度与熔解曲线的差异区分野生型、纯合突变型及杂合突变型,以验证HRM方法的可行性和准确性。结果表明,优化的HRM检测方法能够鉴别野生型、纯合突变型及杂合突变型小鼠胚胎干细胞。应用建立的HRM方法分析30个CRISPR/Cas9技术编辑过的小鼠胚胎干细胞单克隆,结果显示,14个单克隆为杂合突变型、2个单克隆为纯合突变型、14个单克隆为野生型,与测序结果一致,准确率为100%。本研究建立的高分辨率熔解曲线法能对CRISPR/Cas9介导的细胞基因突变进行快速筛选,是一种灵敏、准确、简便、高通量的方法。

人脐带来源的间充质干细胞运载3型呼肠孤病毒在杀伤K562细胞过程中相关细胞因子表达分析

目的选择具有肿瘤归巢能力的人脐带来源的间充质干细胞(MSCs)作为细胞载体运载溶瘤病毒3型呼肠孤病毒(Reovirus3),并与慢性粒细胞白血病K562细胞共同培养,探讨细胞培养体系中相关细胞因子对MSCs运载Reovirus3杀伤K562细胞的影响,为利用细胞因子治疗或者辅助MSCs运载Reovirus3治疗慢性粒细胞白血病提供依据。方法通过体外试验从脐带中分离培养出MSCs,选用对数生长期的MSCs荷载Reovirus3,与对数生长期的K562细胞进行体外细胞培养,分为对照组:K562细胞;MSCs组:K562细胞+MSCs;Reovirus3组(阳性对照组):K562细胞+Reovirus3;实验组:K562细胞+Reovirus3+MSCs。细胞共培养24、48、72 h,收集各组细胞培养上清液,采用ELISA双抗体夹心法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)、转化生长因子-β(TGF-β)、白细胞介素(IL)-2、IL-4、IL-5、IL-6和IL-17水平。结果培养24、48、72 h时MSCs组和实验组TGF-β、IL-6水平与对照组比较均明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05),Reovirus3组比对照组TGF-β、IL-6水平虽有所升高,但差异均无统计学意义(P>0.05);培养48 h时MSCs组、Reovirus3组和实验组TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4水平虽然均高于对照组,但差异均无统计学意义(P>0.05),培养48 h时4组细胞培养上清液均未检测出IL-5和IL-17;培养24、72 h时4组细胞培养上清液均未检测出TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5及IL-17。结论MSCs运载Reovirus3在体外试验的细胞培养体系中可有效抑制K562细胞,除了溶瘤病毒Reovirus3的溶瘤作用外,可能还与培养体系中的细胞因子促进细胞凋亡从而抑制K562细胞的增殖有关。

LRG1抑制小鼠肝巨噬细胞活化从而改善代谢相关脂肪性肝病:基于增强TGF-β1信号通路

目的探讨肝细胞来源的富含亮氨酸α-2糖蛋白1(LRG1)对M1型肝巨噬细胞活化的影响。方法BALB/c小鼠通过高脂饮食(HFD)喂养16周来建立代谢相关脂肪性肝病(MAFLD)模型,油酸诱导小鼠原代肝细胞发生脂肪变性,用RT-PCR和Westernblot检测肝组织和肝细胞中LRG1的mRNA和蛋白水平的表达。将原代肝巨噬细胞分为5组,对照组、脂肪变性肝细胞来源的上清(CM)刺激组、CM+LRG1组、CM+转化生长因子-β1(TGF-β1)组、CM+TGF-β1+LRG1组,各组培养24 h后,Western bot法检测一氧化氮合酶(iNOS)蛋白水平的表达,RT-PCR法检测iNOS、趋化因子1(CXCL-1)和白细胞介素-1β(IL-1β)的mRNA水平的表达。MAFLD小鼠分为4组,1组作为对照(6只),其余3组经尾静脉分别注射LRG1(6只)、TGF-β1(6只)或者TGF-β1+LRG1(6只),收集肝组织,经HE染色观察肝脏病理学变化,免疫组化法观察肝组织中F4/80+细胞的分布,RT-PCR法检测肝组织iNOS、CXCL-1和IL-1β的mRNA水平的表达。结果HFD小鼠肝组织和脂肪变性的肝细胞中LRG1的mRNA和蛋白水平的表达显著降低(P<0.05)。脂肪变性肝细胞来源的CM刺激明显促进肝巨噬细胞中iNOS、CXCL-1和IL-1β的mRNA水平的表达,而TGF-β1和LRG1联合刺激时明显抑制这些分子mRNA水平的表达(P<0.05)。小鼠HFD16周后,单独注射LRG1或TGF-β1均可减少肝内脂质沉积以及肝内巨噬细胞的浸润,二者联合上述改变更加明显。同时,TGF-β1和LRG1联合刺激时也明显抑制iNOS、CXCL-1和IL-1β的mRNA水平的表达(P<0.05)。结论LRG1通过增强TGF-β1信号通路抑制肝巨噬细胞浸润,从而缓解非酒精性脂肪肝的炎性反应。

miR-26b调控Wnt/β-catenin信号通路促进成肝样分化MSCs迁移研究

目的探讨miR-26b与Wnt/β-catenin信号通路、间充质干细胞(MSCs)不同分化状态的关系及其在MSCs向肝细胞生长因子(HGF)趋化迁移过程中的作用。方法以大鼠骨髓来源MSCs作为研究对象,用无血清诱导分化培养基分别培养0、7、14、21d,建立成肝样分化不同阶段的MSCs分化模型,qRT-PCR检测miR-26b在不同分化状态MSCs细胞中的表达;重组腺病毒(Ad-26b)感染MSCs实现miR-26b的高表达,并以空病毒感染MSCs为对照(Ad)后,检测细胞中信号分子active-β-catenin(ABC)、p-β-catenin、β-catenin的表达量以及Wnt/β-catenin经典靶基因c-Myc、RUNX2的转录水平,明确其对MSCs铺展面积和黏着斑的影响以及通过Transwell、Dunnchamber实验,比较其对不同分化状态MSCs趋化迁移的影响。结果随着诱导分化时间的延长,MSCs的miR-26b表达呈上升趋势,14d时,miR-26b的表达至高峰,与对照组比较有统计学意义(P<0.05);Ad-26b组较Ad组ABC蛋白水平升高,p-β-catenin的蛋白水平下降,而β-catenin总蛋白无变化,Wnt/β-catenin信号下游靶基因c-Myc,RUNX2的表达上调。Ad-26b组高表达miR-26b后可促使MSCs铺展面积变小并呈现极性分布,MSCs细小黏着斑数目增加并向细胞前端周边分布。Transwell及Dunncham-ber实验表明MSCs诱导分化至7d,向HGF的趋化迁移能力高于诱导分化0、14和21d。高表达miR-26b组较Ad组细胞向HGF的趋化迁移能力较对照组增强(P<0.05)。结论miR-26b通过调节Wnt/β-catenin信号通路影响MSCs的分化和趋化迁移。

红系祖细胞在造血缺陷斑马鱼体内的移植

目的评估红系祖细胞在先天原始造血缺陷cloche^(-/-)突变体斑马鱼体内的移植效果。方法收集绿色荧光标记红系祖细胞的转基因系zTg(gata1:EGFP)斑马鱼胚胎,制备成单细胞悬液,经流式细胞仪分选出携带绿色荧光的gata1^+细胞,利用显微注射技术将gata1^+细胞移植到42hpf的cloche^(-/-)突变体斑马鱼心脏中,采用体视荧光显微镜追踪观察移植后的红系祖细胞在cloche^(-/-)突变体斑马鱼中的表达情况。结果成功分选出携带绿色荧光的gata1^+细胞,并在移植后2 h可观察到携带绿色荧光的gata1^+细胞逐渐增殖扩散且16 h持续有绿色荧光表达。结论红系祖细胞有重建造血的潜力,为进一步研究红系祖细胞移植后的功能鉴定提供实验依据。

二氢杨梅素对肺癌A549细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨二氢杨梅素(DMY)对肺癌A549细胞增殖、凋亡的影响。方法:将肺癌A549细胞分为DMY组和对照组,DMY组分成5组,分别加入终浓度1、5、10、15及20mg/L的DMY,对照组加入等量DMSO;各组细胞培养72h时,采用MTT法检测细胞增殖抑制率,计算DMY对A549细胞的半数致死量(IC50值);选取IC50值附近浓度的DMY处理细胞,分别在24、48及72h时,采用MTT检测细胞存活率;肺癌A549细胞分为DMY组(终浓度大约为IC50值的DMY)及对照组,细胞培养48h时,采用Hoechst33342/PI双染法结合倒置荧光显微镜检测细胞凋亡,DNAladder凝胶电泳检测细胞内DNA的断裂程度。结果:DMY能显著抑制A549细胞的增殖,细胞抑制率随着DMY浓度的增加逐渐增高(P<0.01),呈明显的浓度依赖性,IC50值为(13.16±0.098)mg/L;以15mg/LDMY处理A549细胞,细胞存活率随着时间的延长逐渐降低(P<0.01),呈明显的时间依赖性;15mg/LDMY孵育A549细胞48h,Hoechst33342/PI染色后荧光显微镜下细胞核内呈现强蓝光,说明细胞处于凋亡状态,DNAladder凝胶实验检测发现凋亡DNA片段明显增加,出现Ladder现象。结论:DMY能抑制肺癌A549细胞增殖并促进其凋亡,可能与染色体DNA断裂有关。

体外扩增的NK细胞运载溶瘤呼肠孤病毒对结直肠癌细胞的杀伤效应

目的:评价体外扩增的人NK细胞能否作为呼肠孤病毒的运载细胞并探讨其临床转化应用价值。方法:体外扩增人NK细胞,用NK细胞装载呼肠孤病毒,激光共聚焦显微镜观察呼肠孤病毒与NK细胞结合的部位。NK细胞运载呼肠孤病毒(Reo-NK)到达肿瘤细胞后,CCK-8法检测在中和抗体的存在下病毒发挥的溶瘤作用;qPCR法检测肿瘤细胞内病毒RNA的相对表达量。CCK-8法检测Reo-NK对结直肠癌KRAS基因突变型(DLD-1)和野生型(CaCo-2、HT29)细胞株的杀伤效应,ELISA双抗体夹心法检测NK细胞释放的穿孔素水平。结果:呼肠孤病毒主要结合于NK细胞膜上,在人AB型血清的存在下体外扩增的NK细胞可将呼肠孤病毒传递到肿瘤细胞,且传递后的呼肠孤病毒仍具有显著溶瘤活性(P<0.01);同时检测到肿瘤细胞内病毒RNA的表达量显著增高(P<0.01)。与NK组相比,Reo-NK组对KRAS基因突变型和野生型结直肠癌细胞株的细胞毒作用均显著增强(P<0.05),穿孔素的释放均明显增加(P<0.05)。结论:体外扩增的人NK细胞适合作为呼肠孤病毒的运载细胞,且呼肠孤病毒能够增强NK细胞的细胞毒作用,两者联合后对结直肠癌细胞可发挥更强的杀伤作用,因而具有重要的临床转化应用价值。

hUC-MSCs对缺氧缺血脑损伤新生大鼠脑组织的保护作用研究

目的通过移植人脐带来源的间充质干细胞(hUC-MSCs)治疗缺氧缺血诱导的新生大鼠缺氧缺血性脑病(HIE),并探讨hUC-MSCs对神经细胞的保护作用及机制。方法采集足月健康新生儿脐带约10 cm,运用组织块贴壁法培养hUC-MSCs,通过感染重组携带绿色荧光蛋白的腺病毒标记细胞;取18只新生健康7d龄SD大鼠,随机均分为对照(假手术)、模型、治疗组,其中模型组及治疗组建立新生大鼠缺氧缺血脑损伤模型,建模成功24 h后将标记的hUC-MSCs注射入治疗组左侧(损伤侧)侧脑室,各组大鼠hUC-MSCs移植治疗48 h后,检测hUC-MSCs在HIE大鼠大脑内的定植并采用TTC染色观察梗死脑组织,RT-qPCR测定海马组织中Beclin-2、Caspase-3 mRNA水平的变化,Western blot检测海马区细胞Beclin-2、Caspase-3蛋白的表达。结果对照组大鼠大脑没有形成梗死体积,模型组大鼠大脑梗死体积明显,梗死体积比为(41.67±4.17)%;治疗组大鼠经hUC-MSCs移植治疗48 h后,大脑梗死体积减小[(16.65±3.43)%],与模型组比较,差异有统计学意义;HIE建模48 h后,内源性Beclin-2、Caspase-3的mRNA以及蛋白的表达上调。hUC-MSCs移植治疗48 h后,Beclin-2、Caspase-3的mRNA以及蛋白的表达下降。结论hUC-MSCs能减小缺氧缺血损伤大鼠大脑梗死体积,对损伤大鼠有保护作用;hUC-MSCs能够减少大鼠脑细胞凋亡,下调缺氧缺血脑损伤大鼠海马区细胞凋亡相关Beclin-2、Caspase-3的mRNA以及蛋白水平。