用安德森空气生物采样器采集病毒气溶胶的研究

目的以表达绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的重组腺病毒(rAdvGFP)为模式病毒,进行气溶胶的主动发生实验和模拟剧烈吹打、振荡混匀等操作,利用安德森采样器进行气溶胶的采集,以建立简单易行的病毒气溶胶采集检测体系。方法用气溶胶发生器模拟模式病毒的气溶胶主动发生,分别在距离发生器管口0、10和20cm处放置采样器及培养皿,在气溶胶发生30s时开始采集,共采集5min。在模拟吹打操作中,将10ml病毒液置于50ml离心管中,用微量移液器反复吸取吹打病毒液;在模拟振荡操作中,将10ml病毒液置于50ml离心管中盖紧,以振荡器最大速度涡旋振荡1min,立即打开管盖采集2min,然后盖紧再重复振荡30s后开盖继续采集。两种模拟操作均在距离管口0和10cm处放置采样器及培养皿,各采集5min。收集各采样器及培养皿中的液体,利用阳离子聚合物聚凝胺浓缩后用PCR方法检测病毒核酸,并接种人胚肾293细胞进行病毒的培养,在荧光显微镜下观察GFP蛋白的表达。结果模拟气溶胶主动发生时,将置于距发生器管口0、10和20cm的采样器和培养皿中的采集液接种细胞均可观察到绿色荧光,并可检测到病毒核酸。模拟剧烈吹打时,置于0cm处的培养皿内可检测到病毒,而置于0cm、10cm处采样器和10cm处培养皿中均未检测到病毒。在剧烈振荡模拟试验中,在距离管口0cm的采样器和培养皿中均可检测到病毒,在置于10cm处的采样器中未检测到病毒,在置于10cm处的培养皿中可检测到病毒。结论利用rAdvGFP模式病毒和安德森采样器初步建立了病毒学实验气溶胶收集检测体系,对模拟危险操作感染性材料所产生的气溶胶做出危险评估,为制定病毒学实验操作规范提供了依据。

以腺病毒为模式分析影响病原微生物2种常用灭活方法可靠性的因素

目的以表达绿色荧光蛋白的重组腺病毒(rAdvGFP)为模式病毒,模拟实验室内利用次氯酸钠灭活含病毒废液和利用紫外线对生物安全柜台面进行消毒的实验室操作,并评价其可靠性及影响因素。方法终浓度为0(阳性对照)、0.5%、0.2%、0.1%、0.05%的次氯酸钠溶液(0.5%、0.2%、0.1%、0.05%次氯酸钠组)分别与rAdvGFP溶液(1×106TCID50)混合后,将混合液原液与混合液的1:10～1:105倍比稀释液分别接种人胚肾293细胞,在荧光显微镜下观察GFP蛋白的表达。将rAdvGFP溶液(1×103TCID50)置于紫外灯下分别照射0(阳性对照)、15、30、60、120min(15、30、60、120min照射组),各组再按垂直照射高度的不同分为5、10、20、30、67cm亚组,照射后收集各组病毒液接种293细胞,在荧光显微镜下观察GFP蛋白的表达。实验均重复3次。结果各组次氯酸钠病毒混合液原液均造成细胞不同程度的损伤,其中0.5%次氯酸钠组混合液原液对细胞的毒性作用较强;稀释10倍后,除0.05%次氯酸钠组外,其余各浓度次氯酸钠组稀释液均导致细胞不同程度的死亡;稀释102倍后,仅0.5%次氯酸钠组稀释液仍对细胞具有毒性作用。荧光显微镜下观察显示,仅0.1%次氯酸钠组的1:10、1:102倍稀释液和0.05%次氯酸钠组的1:10、1:102、1:103倍稀释液接种细胞可见绿色荧光。紫外线照射后在荧光显微镜下观察显示,15min照射组的各亚组细胞均可见明显绿色荧光;30min照射组的20、30、67cm亚组与60、120min照射组的67cm亚组细胞仍可见绿色荧光。结论有效氯浓度须在0.2%以上、安全柜内1.12mW/cm2强度紫外线照射30min以上方能有效灭活重组腺病毒,建立实验室操作的可靠性评价技术体系并据此制定标准操作规程很有必要性。

中国献血人群中人细小病毒B19的分子流行病学调查

目的人细小病毒B19(Human parvovir-usB19)属于细小病毒科(Parvoviridae),嗜红细胞病毒属(Erythrovirus)。B19是1种单链无包膜病毒,其病毒基因组长约5.6kb,目前B19在世界范围的流行株有3种基因型。B19可通过呼吸道传播,引起胎儿水肿、宫内死胎、自发性流产、传染性红斑、急性关节炎等多种疾病。B19还可通过血液和血液制品传播,并且可抵抗大多数病毒灭活/去除方法,显示其在输血安全中的重要性。然而其在中国献血人群中的存在情况、流行株和病毒的载量还不清楚。由于B19有较高的发病率,献血者B19感染时会出现较高的病毒血症,因而用于加工的大量汇集血浆中会含有B19病毒。在欧美等国家都将小样本汇集的Q-PCR方法引入了他们的血液筛查方案中,病毒载量高于104IU/ml的样本都要拆分和废弃。在我国,B19的检测并没有被列为血液制品的筛查项目。本研究旨在调查中国献血人群中人细小病毒B19的病毒DNA和血清学流行率,了解我国B19病毒在献血人群中的流行情况,对我国未来的献血筛查策略提供数据支持。同时,献血人群中,存在一部分HIV感染者,而B19感染免疫缺陷病人,能造成严重的慢性贫血,并由于机体无法形成B19抗体或抗体无效,因而造成持续性感染。本研究也检测了HIV阳性献血者中人细小病毒B19的病毒DNA和血清学流行率,了解我国B19病毒在HIV阳性献血人群中的流行情况,并对B19病毒在正常人群和免疫缺陷人群中不同的表现进行比较研究,从而对这一人群的抗病毒治疗提供指导。

双抗体夹心酶联免疫吸附实验检测诺如病毒

诺如病毒属于杯状病毒科，是引起急性非细菌性胃肠炎的主要病原，广泛分布于世界各地。虽然诺如病毒胃肠炎是温和的、自限性的疾病，但是它发病率高，感染广泛，导致住院和死亡人数的增加。危害人类的诺如病毒可分为GGI和GGII两个遗传组（genogroup），近来的研究表明，GGI和GGII至少分别由14和17个遗传型（genotype）组成。目前全世界范围内流行的诺如病毒毒株绝大部分是GGII组，GGI在我国很少见，因此，GGII组应为诺如病毒的主要防控对象。

38kD抗原特异TCR基因修饰T细胞的抗结核抗原活性研究

抗原特异T细胞受体(Tcell receptor,TCR)基因修饰T细胞已被应用于肿瘤、病毒感染过继免疫治疗研究,取得了鼓舞人心的结果,但在结核上未见报道.本研究利用结核分枝杆菌38kD抗原刺激人CD4+,CD8+T细胞,通过分析刺激前后T细胞TCR互补决定区3(complementarity determining region 3,CDR3)谱型,从CD4+,CD8+T细胞中分别筛选出38kD抗原特异的TCR Vα11,Vβ8和Vα3,Vβ8基因家族T细胞,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增获得其α,β链全长基因并插入逆转录病毒载体,构建重组载体pMX-β8-IRES-α11-GFP(pβ8α11)和pMX-β8-IRES-α3-GFP(pβ8α3),分别转染初始CD4+,CD8+T细胞,检测其体外抗结核抗原活性.结果显示,TCR基因修饰的CD4+,CD8+T细胞均表达外源性TCR,不仅能特异性识别抗原,且介导免疫效应功能,表明结核抗原特异TCR基因修饰的T细胞具有应用于多药耐药结核患者过继细胞免疫治疗的可能.

轮状病毒NSP1蛋白的泛素连接酶活性研究

目的 通过实验确证轮状病毒（Rotavirus,RV）非结构蛋白1（NSP1）的泛素连接酶活性,为阐明其在RV复制和致病机制中的作用提供线索.方法 将NSP1基因及其RING结构域缺失突变体构建到pEGFP-C1质粒上,与表达泛素的质粒pBlue-Script-HA-Ubiquitin共转染人胚肾293FT细胞,用免疫荧光和Western blot方法 确定蛋白的表达,并通过免疫共沉淀方法 分析蛋白的泛素化.结果 NSP1蛋白的表达可增加细胞内的泛素化水平,并且自身也发生泛素化.结论 NSP1蛋白具有E3泛素连接酶活性.可能在泛素化调控机制中发挥作用.

人博卡病毒结构和非结构蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的原核表达、纯化人博卡病毒(Human bocavirus,HBoV)结构蛋白(VP2)和非结构蛋白(NS1和NP1),并制备多克隆抗体。方法采用PCR法扩增HBoV VP2、NS1和NP1基因,克隆入原核表达载体pET-30a(+)中,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经离子交换和Ni2+金属螯合层析纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析,并免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,ELISA法检测多抗效价。结果重组原核表达质粒pET-30a-VP2、pET-30a-NS1和pET-30a-NP1经双酶切和测序证实构建正确;重组VP2蛋白以包涵体形式表达为主,重组NP1蛋白以可溶性表达为主,重组NS1蛋白为包涵体形式表达,表达量分别为菌体总蛋白的20%、40%和30%;纯化的重组蛋白纯度分别可达85%、95%以上和80%,免疫BALB/c小鼠制备的多克隆抗体效价分别为VP2和NP1高于1∶16 000,NS1为1∶8 000。结论已成功表达了HBoV VP2、NS1和NP1蛋白,并制备了高效价的多克隆抗体,为进一步研究HBoV的致病机制及开展流行病学调查等提供了材料。

志贺菌研究进展

志贺菌是革兰氏阴性、胞内兼性厌氧菌,它引起的志贺菌病对人类健康造成重大影响.全球每年有1.6亿病例,其中死亡110万.志贺菌可分为4个血清群:痢疾志贺菌、福氏志贺菌、鲍氏志贺菌和宋内志贺菌.各血清群代表株全基因组测序工作的完成,使得相关研究进入了全基因组时代.本文简要总结了志贺菌在基因组学、转录组学、蛋白质组学和结构生物学方面的研究进展.

红色毛癣菌不同生长阶段的基因表达谱分析

红色毛癣菌是最重要的浅表感染真菌.目前对红色毛癣菌分子和遗传学方面的研究还比较有限.应用cDNA芯片技术对红色毛癣菌不同生长阶段的基因表达谱进行了分析,获得了2044个在不同生长阶段差异表达的基因.聚类分析表明,这些基因可以分为3种不同的表达模式.本研究验证了先前的结论,即在红色毛癣菌中存在预储存的mRNA.对不同生长状态下转录谱和基因功能分析表明,糖酵解过程中的一些重要的酶具有相似的表达模式,说明在红色毛癣菌的生长过程中,这些酶可能具有共同的调控模式.同时,在红色毛癣菌生长过程中,一些参与诸如小GTPase调控、cAMP依赖的调控途径以及MAPK信号传导途径的基因表达也发生了变化.尽管这些基因和相关的调控途径在红色毛癣菌中的具体生物学功能还不清楚,但它们可能在其生长过程中起了调控作用.

肠道病毒71型诱导Bax依赖的细胞凋亡

目的研究肠道病毒71型（EV71）诱导细胞凋亡的分子机制。方法采用CCK8比色法检测EVT1感染对于人横纹肌肉瘤细胞RD增殖的影响，通过Hoechst33342染色和Caspase3活性测定检测细胞凋亡特征，用WesternBlot方法检测凋亡相关蛋白Caspase3和8的激活。同时通过免疫共沉淀检测EV71感染后细胞内Bax的活化。结果EV71感染RD细胞可以明显抑制细胞增殖，引起Caspase3、8和PARP蛋白的激活，同时引起Bax蛋白表达增加并发生构象变化。结论EV71通过Bax构象变化诱导Caspase依赖的细胞凋亡。

人IgG Fc标签融合表达载体的构建及H5 HA1融合蛋白的表达

目的构建人IgG Fc标签融合表达载体,表达并纯化H5 HA1融合蛋白。方法以pCAGGS载体为基础,依次插入IL-2信号肽及人IgG Fc片段,构建人IgG Fc标签融合表达载体。将H5 HA1克隆至含人IgG Fc标签的融合表达载体pCAGGS-F-IL-2/Fc中,瞬时转染293T细胞,进行融合蛋白的表达。表达的蛋白经Protein G亲和层析一步法纯化。结果人IgG Fc标签融合表达载体经酶切及测序证明构建正确;在293T细胞中分泌表达的H5 HA1与人IgG Fc的融合蛋白HA1-Fc相对分子质量约75 000,转染后72和96 h表达量最高;纯化的融合蛋白纯度达90%以上,含量为1.63μg/ml。结论成功构建了人IgG Fc标签融合表达载体,表达并纯化了HA1-Fc融合蛋白,为流感病毒侵入及免疫机制的研究奠定了基础。

TRIM38蛋白对核转录因子NF-κB的影响

目的TRIM家族是一类结构保守的蛋白家族，目前发现其包含70多种成员，参与了增值、分化、细胞凋亡及病毒与宿主的免疫应答等。TRIM38的功能尚不清楚。本研究拟通过实验确证TRIM38对核转录因子NF—KB活性的调节。方法在293T细胞中过表达TRIM38，采用荧光素酶报告系统检测TRIM38及其结构与缺失突变体对NF—KB启动子活性的影响。用WesternBlot方法检测TRIM38蛋白的表达。结果TRIM38可以激活NF—KB，并且在构建的TRIM38保守结构域的缺失突变体中，只有SPRY结构域缺失后不影响TRIM38的功能。结论TRIM38是一个不依赖于SPRY结构域的NF—KB的激活蛋白。