临床用间充质干细胞的质量控制研究

科学界取得的突破性进展正在使干细胞治疗疾病成为可能，美、英、法、韩、印、中等国均开展了多项间充质干细胞制品的临床研究。但由于研究机构间缺乏统一规范，各机构对于干细胞制品无统一的衡量标准，造成研究结果无法相互认可和形成公认的结论，阻碍了研究进程；任何一项科学研究都是循序渐进的，干细胞作为新型治疗手段，在其分离、扩增、制备、贮存、传送、回输等过程中，制品的一致性、稳定性如缺乏有效的控制方法，将导致干细胞治疗的安全性、有效性评价很难实现；随着对干细胞的认识不断加深，广大科研工作者结合自身的研究，提出自己的经验和体会，不断与国际标准接轨，对提高我国干细胞研究的水平具有重要意义。欢迎全国各有关单位和专业人员踊跃参与讨论，为临床用间充质干细胞的质量研究建言献策，使这项技术健康有序的发展，造福广大患者。

人促血液血管生成素的原核表达、分离纯化及活性分析

目的利用基因工程技术获得重组的人促血液血管生成素(HAPO),以探讨其对骨髓细胞的作用。方法提取人胎肝总RNA,利用RT-PCR、克隆HAPO cDNA插入表达载体pET32c,使之在大肠杆菌BL21(DE3)中表达;用DEAESepharose Fast Flow阴离子交换柱、Ni-Chelating Sepharose Fast Flow亲和柱以及SP Sepharose Fast Flow阳离子交换柱分离纯化,肠激酶酶切,液体培养小鼠骨髓细胞。结果经IPTG诱导HAPO实现了在大肠杆菌中的可溶性表达,经一系列层析获得融合的rh-HAPO,肠激酶酶切除去N-端融合部分后,获得高纯度的rh-HAPO。液体培养小鼠骨髓实验发现rh-HAPO可促进CD34+细胞和flk-1细胞的增殖。结论重组蛋白rh-HAPO可促进造血干/祖细胞的增殖。

人血液血管细胞生成素的胎肝免疫印记检测

目的:制备一种新蛋白——人血液血管细胞生成素(hemangiopoietin,HAPO)的单克隆抗体,检测其在胎肝中的表达。方法:杂交瘤方法制备抗HAPO的单克隆抗体;非竞争酶联免疫吸附实验测定抗体的相对亲和力;蛋白G亲和层析纯化腹水中的抗体,免疫印记方法检测胎肝中天然HAPO的表达。结果:所获单抗分别为IgG1及IgM,其轻链均为κ。三株IgG1亚类单抗的相对亲和力分别为3.06×109mol/L,6.07×108mol/L和1.71×1010mol/L。亲和纯化后抗体的纯度达99%以上。胎肝中在蛋白水平上可以检测到HAPO的表达,天然HAPO的分子量接近于重组HAPO的分子量。结论:人胚胎肝组织中在蛋白水平上可以检测到HAPO的表达。

人胎盘绒毛膜来源间充质干细胞的生物学特性

背景:骨髓是间充质干细胞的主要来源,但骨髓中间充质干细胞数量和质量会随着年龄的增长而逐渐降低。因此,寻找一种新的干细胞来源具有重要意义。目的:分离研究了一种新的间充质干细胞来源——人绒毛膜来源间充质干细胞,并研究其生物学特性。方法:将胎盘冲洗干净后,分离出脐带和羊膜组织,将剩余的胎盘组织进行原代和传代培养。通过短串联重复序列分析检测细胞是否来源于绒毛膜,用MTT法检测细胞生长方式,流式细胞仪分析细胞表型及干细胞标记,使用不同的诱导分化培养基检测其多向分化的能力。将该细胞与植物血凝素刺激的外周血单个核细胞共培养,用酶联免疫吸附试验检测上清γ-干扰素的水平。结果与结论:短串联重复序列分析证明所得到的细胞来源于绒毛膜,这种绒毛膜来源的细胞生长呈典型的成纤维细胞形态。细胞表达常见的间充质干细胞表面标记CD90、CD73、CD105、CD44,不表达CD45,CD11b和CD34。同时,细胞也表达Nestin和Sox-2。在不同的条件培养基培养状态下,细胞可向成骨、成脂方向分化。这些结果证明所得到的细胞为人绒毛膜间充质干细胞。这些绒毛膜间充质干细胞能抑制植物血凝素刺激的人外周血单个核细胞分泌γ-干扰素。可见绒毛膜来源的间充质干细胞具有和传统的骨髓来源间充质干细胞具有相似的生物学特性。

人脐带间充质干细胞条件培养基体外支持造血的功能

本研究旨在探讨单纯人脐带间充质干细胞(hUC-MSC)的条件培养基对脐血CD34+细胞体外造血支持作用。分离得到的hUC-MSC以2×106接种于75 cm2培养瓶中,48 h后收集培养上清作为条件培养液。用人脐血CD34阳性分选试剂盒分选CD34+细胞。将CD34+细胞接种在3个培养体系中:hUC-MSC条件培养液+不完全甲基纤维素培养基、完全甲基纤维素阳性培养基和含10%胎牛血清的DMEM/F12+不完全甲基纤维素作为阴性培养基。培养14d观察集落的形态特征,统计细胞数≥50的造血集落单位数。流式细胞术检测组成集落形成单位的细胞免疫表型。结果表明:hUC-MSC条件培养基中能够形成集落形成单位,且以粒系和粒-巨噬集落形成单位为主(CFU-G 47.67±0.58、CFU-GM 48.67±4.73、CFU-M 3.00±2.00),未观察到红细胞系相关的集落形成单位。阳性培养基中各种集落形成单位均可见,阴性培养体系中无集落形成单位。流式细胞术检测条件培养基组CD45+细胞比例为(97.43±2.15)%,显著高于阳性对照中CD45+细胞比例(39.69±0.96)%(P<0.05)。结论:在体外hUC-MSC条件培养基能够促进CD34+细胞的发育分化,单纯hUC-MSC条件培养基具有造血支持功能,并促进CD34+细胞向髓系分化,但不能促进向红细胞分化。

IL-1β促进脐带间充质干细胞的造血支持作用

本研究旨在探讨IL-1β对人脐带间充质干细胞(hUC-MSC)的造血支持的影响。将分离得到的hUC-MSC以2×106接种于75 cm2培养瓶中,贴壁2 h后,加入10 ng/ml IL-1β培养36 h后收集培养上清和细胞。观察有/无IL-1β的条件培养液对CD34+细胞造血支持的影响;real time PCR检测加/不加IL-1βMSC的造血相关因子mRAN的变化;ELISA法检测造血相关因子的差异。结果表明,含有IL-1β的MSC条件培养液能明显增强CD34+细胞集落形成能力,且以粒系和粒-单核集落形成单位为主。IL-1β促进了MSC GM-CSF、G-CSF、IL-6的mRNA的表达,促进GM-CSF、G-CSF、IL-6蛋白自脐带MSC的分泌。结论:IL-1β能够增强MSC的造血支持能力,尤其是向髓系分化的能力。

不同供者来源及不同传代次数人脂肪间充质干细胞端粒酶的活性检测

背景:目前对于脂肪间充质干细胞端粒酶的表达尚无统一定论。目的:探讨不同供者来源和不同传代次数的成人脂肪间充质干细胞是否表达端粒酶活性。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2009-08在中国医学科学院血液学研究所泰达生命科学技术研究中心完成。材料:成人脂肪组织来源于天津怡丽医学美容整形门诊接受抽脂术的5例健康供者,Hela细胞由中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心提供。方法:分别从每例健康供者抽取20mL脂肪组织,胶原酶消化法体外分离培养人脂肪间充质干细胞,待细胞生长至80%融合时胰酶消化传代。以Hela细胞作为对照,加入含体积分数为10%胎牛血清的1640培养基,待细胞生长至80%融合时胰酶消化传代。主要观察指标:人脂肪间充质干细胞的形态、表型、分化潜能,RT-PCR法检测人脂肪间充质干细胞端粒酶基因的表达,TRAP-ELISA法检测人脂肪间充质干细胞的端粒酶活性。结果:实验分离得到的人脂肪间充质干细胞呈贴壁生长,显微镜下呈梭形,当细胞密度较大时表现出漩涡状生长;CD19,CD34,CD11b,CD45,HLA-DR呈阴性表达,CD73,CD90,CD105呈阳性表达;成脂诱导后油红O染色可见明显红色油滴,成骨诱导后VonKossa染色可见黑色颗粒,提示有钙沉积。P1,P4,P7代人脂肪间充质干细胞均不表达端粒酶反转录酶基因,5例不同供者来源的脂肪间充质干细胞亦均不表达端粒酶反转录酶基因。Hela细胞具有端粒酶活性,人脂肪间充质干细胞不表达端粒酶活性。结论:不同供者来源和不同传代次数的人脂肪间充质干细胞均不表达端粒酶mRNA,也无端粒酶活性。

大鼠胎盘来源间充质干细胞的生物学特性

背景:研究报道,人间充质干细胞用于实验动物研究的结果不令人满意,所以考虑使用大鼠胎盘来源的间充质干细胞用于动物实验研究,以期获得更好的实验结果。查阅国内外相关文献,目前尚未发现大鼠胎盘来源间充质干细胞的相关报道。目的:建立从大鼠胎盘分离间充质干细胞的方法,观察其基本生物学特性。方法:通过胶原酶消化法从大鼠胎盘分离并得到间充质干细胞。每天用倒置显微镜观察其形态。用MTT法测定其生长动力学并绘制生长曲线。用流式细胞仪检测其表型及细胞周期。通过免疫组化法证实其成脂及成骨分化的潜能。结果与结论:原代细胞培养8h后细胞贴壁,24h内细胞形成集落,第4代细胞大小、形态基本一致,以梭形为主。细胞周期检测提示G0/G1期、S期、G2期的比例分别为83.76%,8.01%,8.23%。免疫表型分析其表达CD29和CD90,不表达CD45。体外诱导实验证实胎盘间充质干细胞具有成脂和成骨分化的潜能。

CD151对人脐带来源间充质干细胞生物学特性的影响

目的:探讨CD151对人脐带来源间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)生物学性状的影响。方法:使用siRNA干扰hUC-MSCs表面CD151,实验分为实验组(siRNA-CD151组)和对照组(siRNA-NC组);流式细胞术检测干扰72 h后hUC-MSCs CD151及其它细胞表型,von Kossa和油红O染色检测体外成骨、成脂诱导分化情况;流式细胞术分析细胞周期变化;real-time PCR检测hUC-MSCs CD151、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)、转化生长因子β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)、环氧合酶2(cy-clooxygenase 2,COX-2)和吲哚胺2,3-双加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)mRNA的表达量;ELISA检测hUC-MSCs HGF分泌量。结果:(1)流式细胞术检测发现干扰72 h hUC-MSCs实验组CD151(11.97±2.63 vs95.66±1.56;P<0.01)和CD105(93.66±0.21 vs 83.37±0.71;P<0.05)较对照组显著降低;real-time PCR检测hUC-MSCs CD151 mRNA变化和流式结果一致。(2)给予siRNA-CD151后能够减缓细胞周期进展,表现为细胞G1期增多,S期减少。(3)实验组hUC-MSCs HGF和TGF-β1表达量低于对照组(P<0.01),而COX-2表达量升高(P<0.05),IDO无明显改变;ELISA检测显示实验组hUC-MSCs HGF分泌量较对照组下降(P<0.01)。结论:体外干扰CD151后hUC-MSCs仍保持干细胞表型,体外成脂诱导分化能力无明显变化,但成骨诱导分化能力、增殖能力和相关免疫调节因子表达发生改变。

环孢素对人脐带间充质干细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响

目的:探讨环孢素(CsA)对人脐带间充质干细胞(UC-MSC)增殖、凋亡和细胞周期的影响。方法:培养已被不同浓度CsA处理的UC-MSC,用MTT比色法观察各组UC-MSC增殖,用流式细胞术检测各组细胞凋亡及细胞周期。结果:CsA对UC-MSC增殖无明显抑制作用;CsA可促进UC-MSC凋亡,当CsA药物浓度≥240ng/ml,其细胞凋亡率与药物浓度呈正相关;CsA可改变UC-MSC细胞周期进程,使G0/G1期细胞比例下降,S期细胞比例增高,呈现浓度依赖性。结论:CsA对UC-MSC的细胞学功能无明显负作用。

TNF-α增强人脐带间充质干细胞条件培养基的体外造血支持功能

目的:研究肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)刺激后所得的脐带间充质干细胞条件培养基对脐血CD34+细胞在半固体培养基中集落形成个数及种类的影响。方法:将3～6代人脐带来源间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)以2×106接种到75cm2培养瓶中,其中刺激组加入TNF-α(10 g/L),48 h后收集上清作为条件培养基。Real-time PCR检测hUC-MSCs中各类造血因子mRNA的表达量。密度梯度离心法分离脐血单个核细胞,磁珠分选CD34+细胞,流式细胞术检测细胞纯度后分5组接种到6孔板内:TNF-α刺激hUC-MSC上清+不完全甲基纤维素培养基;hUC-MSC上清+不完全甲基纤维素培养基;TNF-α+DMEM/F12完全培养基+不完全甲基纤维素培养基;完全甲基纤维素培养基;DMEM/F12完全培养基+不完全甲基纤维素培养基。10 d后显微镜下计数各类集落形成单位(colony-forming unit,CFU)的数目,收集集落形成细胞,流式细胞术检测其表型特征。结果:(1)TNF-α刺激后hUC-MSCs中粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)和白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)mRNA表达上调。(2)两种条件培养组均可见粒系CFU(granulocyte CFU,CFU-G)、巨噬系CFU(macrophage CFU,CFU-M)和粒巨噬系CFU(granulocyte-macrophage CFU,CFU-GM),但TNF-α刺激组CFU-G和CFU-M的数目约为未刺激组的1.5倍,CFU-GM约为未刺激组的2倍;阳性对照组中除粒系、巨噬系集落外还可见红系集落;而DMEM/F12完全培养基加或不加TNF-α组10 d后均未见集落形成。(3)流式细胞术检测TNF-α刺激组与未刺激组集落细胞表型CD14、CD45和CD11b,未见明显差异。结论:hUC-MSC上清作为条件培养基可在体外促进CD34+细胞分化增殖为髓系细胞,具有造血支持作用,TNF-α刺激后此作用增强。

长期体外扩增降低胎盘绒毛膜间充质干细胞的免疫调节功能

本研究主要探讨长期体外培养的胎盘绒毛膜间充质干细胞的各项生物学活性和免疫调节功能的变化。显微镜检观察比较第3代和第9代胎盘绒毛膜的形态,用流式细胞术分析它们的免疫表型。把第3代和第9代CV-MSC与PHA活化的PBMNC共培养,ELISA方法检测其IFN-γ的分泌水平。实时定量PCR的方法检测CV-MSC细胞中COX-2,HGF和HLA-G的表达。结果显示:经过长期传代后,虽然CV-MSC的基本细胞形态和大部分表面标记如CD31,CD34,CD44,CD45,CD62L,CD73,CD90,CD105,CD117,CD151,CD235a,CD271和HLA-DR等都没有明显的变化,但其表面CD49d表达明显上调,长期传代后其免疫调节功能明显下降,免疫调节相关的分子COX-2和HGF的表达也略有下调,而HLA-G表达并未明显的变化。结论:长期体外扩增改变CV-MSC的CD49d的表达,并降低CV-MSC的免疫调节功能。

玻璃体腔移植人脐带间充质干细胞诱导的神经干细胞对糖尿病大鼠血-视网膜屏障的保护作用

目的：探讨由人脐带间充质干细胞（hUCMSC）体外诱导的神经干细胞（NSC）经玻璃体腔注射途径移植对糖尿病视网膜病变（DR）大鼠血-视网膜屏障（BRB）的保护作用。方法实验研究。应用随机数字表法将60只Sprague-Dawley（SD）大鼠随机分为正常对照组、DR模型对照组及NSC治疗组。DR模型对照组和NSC治疗组大鼠腹腔注射STZ建立糖尿病模型。于糖尿病成模后3个月，NSC治疗组大鼠右眼玻璃体腔注射2μl NSC悬液；DR模型对照组大鼠右眼注射等容量PBS；上述两组大鼠左眼及正常对照组大鼠双眼不给予任何干预。干预后1个月，采用伊文思蓝（EB）灌注血管视网膜铺片观察视网膜血管形态及渗漏情况；EB定量检测BRB破坏情况；观察视网膜组织病理学改变情况。组间总体差异采用单因素方差分析，组间两两比较采用Dunnett t检验。结果 EB灌注视网膜铺片检查显示，正常对照组大鼠视网膜血管无明显异常，无EB渗漏到血管外；DR模型对照组背景荧光增强，可见明显的EB渗漏高荧光区；NSC治疗组背景荧光略增强，EB渗漏区较DR模型组明显减少。EB渗漏定量分析显示，正常对照组、DR模型对照组及NSC治疗组EB平均渗漏量分别为（9.91±1.53）、（24.67±2.26）及（12.85±2.58）μg/g，组间总体差异有统计学意义（F=103.801，P〈0.01）。DR模型对照组大鼠视网膜平均EB渗漏量较正常对照组增加（q=15.306，P〈0.05）；NSC治疗组较DR模型对照组明显减少（q=9.748，P〈0.05）。视网膜组织病理学检查示正常对照组视网膜各层结构清晰、排列整齐、形态正常；DR模型对照组视网膜细胞排列较紊乱，神经纤维层水肿明显，细胞核肿胀、体积增大，细胞密度降低；NSC治疗组视网膜细胞较DR模型对照组略整齐，介于两组之间。结论 hUCMSC诱导的NSC经玻璃体腔途径移植，能够改善BRB功能，减少早期DR大鼠血管渗漏，从而达到防治DR进展的治疗作用。（中华眼科杂志，2017，53：53-58）

人端粒酶催化亚基(hTERT)实时荧光定量PCR标准品的构建

目的:构建用于检测人端粒酶催化亚基(hTERT)实时荧光定量PCR标准品。方法:通过逆转录PCR扩增得到目的片段后连接至pMD18-T载体,转化DH5α感受态细胞。分别经PCR和测序验证重组质粒的正确性。分光光度计测量重组质粒的吸光值,换算成拷贝数浓度后作梯度稀释制得质粒标准品。10倍梯度稀释质粒标准品后进行实时荧光定量PCR分析。结果:人端粒酶催化亚基(hTERT)基因片段成功克隆至pMD18-T载体之中,重组质粒序列完全正确。实时荧光定量PCR分析10倍梯度稀释的质粒标准品所得标准曲线良好。结论:成功构建了人端粒酶催化亚基(hTERT)实时荧光定量PCR标准品。