原发性皮肤淀粉样变一家系OSMR基因突变研究

目的:明确原发性皮肤淀粉样变(PCA)的致病基因抑瘤素M受体(OSMR)突变情况。方法:提取一PCA家系3例患者及22名正常成员的外周血DNA,应用PCR扩增OSMR基因外显子,并对产物进行测序。结果:该家系3例患者OSMR基因的第15外显子中均检测出c.2081C>T(p.Pro694Leu)错义突变,而家系内正常人未见该突变。结论:该家系患者发病可能与OSMR基因第15外显子突变有关。

先天性白内障致病基因研究进展

白内障是世界第1位致盲性疾病,先天性白内障是造成儿童失明和弱视的重要原因。晶状体分化成熟过程受到很多基因调控,形成一个精密的调控网络。其中任何一个调控环节发生异常都可能引起晶状体透明性改变,导致白内障的发生。本文分别从晶状体蛋白基因、细胞骨架蛋白基因、膜蛋白基因、发育及转录因子基因、相关酶基因及其他基因等分类切入,对先天性白内障的致病基因研究进展进行综述。

先天性厚甲基因突变分析

先天性厚甲（PC）是一组常染色体显性遗传的外胚层发育不良性遗传病,特征为指/趾甲营养不良和掌趾角化,由Jadassohn和Lewmldowsky于1906年首次报道[1]。PC的特征性表现为指/趾甲显著增厚、掌跖过度角化、毛囊角化病,舌和口腔黏膜白斑,偶尔累及喉部引起声音嘶哑[2]。1 PC分型传统上按症状PC主要分为2型：PC-1型和PC-2型,此外,还有一些罕见的变异,

贲门癌中染色体8p21-p23杂合性丢失的研究

染色体Sp21-p23区域存在与多种肿瘤相关的抑癌基因。为明确该染色体区域的抑癌基因与贲门癌的关系，我们进行了贲门癌中染色体8p21-p23区域微卫星标记的杂合性丢失研究。首先采用激光捕获显微切割技术从19例贲门癌组织中获得均质的肿瘤细胞及正常的胃粘膜细胞，然后利用多重置换扩增技术扩增捕获细胞的全基因组DNA。选择覆盖染色体8p21-p23区域的13个微卫星标记，利用PCR结合硝酸银染色方法分析了肿瘤细胞中染色体8p21-p23的杂合性丢失情况。结果显示，在贲门癌中染色体8p21-p23的总丢失频率高达63．2％（12／19），单一标记的丢失频率为25％～55．6％。根据不同肿瘤组织中杂合性丢失的情况，我们确定了一个最小缺失区域，即8p22GGAA-8p22ATCT标记间约1．2Mb的范围。研究结果表明，染色体8p22区域抑癌基因在贲门癌发生发展中起重要作用；染色体最小重叠区域的确定对最终鉴定该区域内的抑癌基因有参考价值。

RNA干扰技术及其在肿瘤研究领域的进展

RNA干涉(RNAinterference,RNAi)是广泛存在于生物体内的一种通过双链RNA(double-strandedRNA,dsRNA)来抵抗病毒入侵和调节基因表达的自然机制。RNAi自1998年首先提出以来,一直是分子生物学领域的研究热点。近几年的研究基本阐明了RNAi的机制,可分为较长dsRNA经RNaseⅢ内切酶Dicer的切割、RISC的组装和目的mRNA的降解3个阶段,并且在RNAi作用特征和应用的研究上取得了较大进展。小干涉RNA(smallinterferingRNA,siRNA)在哺乳动物细胞中介导转录后基因沉默(post-transcriptionalgenesilen-cing,PTGS),因其具有高效性和序列特异性,已经成为功能基因组学研究的有力工具之一,尤其在肿瘤相关基因的研究和肿瘤基因治疗研究领域取得了突破性进展。

多重置换扩增结合激光捕获显微切割技术在胃癌基因组学研究中的应用

目的探讨多重置换扩增(MDA)与激光捕获显微切割(LCM)技术相结合,并应用到胃癌细胞杂合性丢失(LOH)分析等研究的可行性。方法利用LCM技术从胃癌组织冰冻切片中分别获取正常胃黏膜细胞和胃癌细胞,提取基因组DNA后,进行全基因组多重置换扩增。进而,将MDA产物用于聚合酶链反应(PCR)扩增ACE2、TP53和ACTB基因片段,以及微卫星位点的LOH分析。结果位于不同染色体的3个基因片段均得到较好的扩增,而且MDA产物的扩增效率明显高于未经MDA的基因组DNA。另外,MDA产物的LOH分析结果与未经MDA的基因组DNA结果一致。结论MDA与LCM技术相结合,是一种可行的全基因组扩增技术路线,可用于后续的基因组学研究。

胃癌癌变过程中Smad4表达的变化及其与临床病理特征的关系

目的:探讨胃癌癌变过程中Smad4蛋白的表达变化及其与临床病理特征的关系.方法:利用组织病理学和免疫组织化学的方法,对103例胃癌患者(早期16例,进展期87例)的石蜡标本进行了病理学分类,并检测各级病变中Smad4蛋白的表达情况.结果:其中在28例标本中同时检出肠上皮化生,在13例标本中检出不典型增生,有2例标本同时检出肠上皮化生和不典型增生.癌旁的正常胃黏膜细胞均有Smad4蛋白表达,在肠上皮化生和不典型增生中表达阳性率分别为89.3%和76.9%.在癌细胞中则为54.4%,其中早期癌为62.5%,进展期癌为52.9%.随着恶变程度的增加,Smad4蛋白表达下降的频率显著升高(P<0.05).Smad4蛋白表达与癌细胞的分化程度密切相关(P<0.01),低分化癌细胞中Smad4蛋白表达下降的频率更高,为63.0%,而高分化癌细胞中Smad4蛋白表达下降的频率仅为31.6%.贲门部癌Smad4蛋白的表达阳性率明显高于其他部位(P<0.05),为75%.胃底、胃体和胃窦部癌的表达阳性率基本相似,分别为50%,53.6%和46.7%.Smad4蛋白表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、淋巴结转移、浸润深度未见明显相关性.结论:Smad4蛋白表达下降是胃癌癌变过程中频发的分子事件,并且与细胞恶变的进展程度和分化程度密切相关,但在贲门部癌中表达下降的频率较低.

基因诊断尿黑酸尿症1例

患儿,男,9个月,因发现尿液放置一夜后颜色变黑而就诊。患儿4个月时家长发现其尿布上黑褐色斑迹,未引起重视。父母非近亲婚配,该患儿为足月剖腹产出生,系第2胎第1产,人工喂养,无家族史。

我国诺里病家系NDP基因的突变分析

目的对我国诺里病一家系进行致病基因突变的鉴定，确定其家系中是否存在ⅣDP基因突变。方法基因家系研究。发现一个3代均患有诺里病的家系，共13人，患者3人，现存患者仅先证者1人，为20月龄男孩。根据诺里病家族史、临床体征及眼科B超检查对患者进行临床诊断；采集该家系成员外周血标本，常规提取基因组DNA；设计并合成3对特异性引物，通过PCR扩增NDP基因的外显子及外显子与内含子交界区，PCR产物直接测序；通过PCR产物限制性内切酶分析和基因型分析对家系所有13名成员进行突变鉴定。结果基因测序结果显示先证者及其母亲均具有NDP基因突变C．220C〉T（P．Arg74Cys），且先证者为该突变的半合子，其母为该突变的携带者；NDP基因突变鉴定表明家系中另外4个表型正常的个体（Ⅲ3、Ⅳ4、Ⅲ5和Ⅱ2）均为该突变的携带者。结论我国诺里病一家系中发现存在NDP错义突变C．220C〉T。

应用DHPLC技术检测非缺失型DMD致病基因的新突变

目的建立检测 Duchenne 型肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy,DMD)致病基因 dystrophin 突变的快速、敏感的微小突变筛查系统。方法选择经多重 PCR 检测未发现dystrophin 基因大尺度缺失的 DMD 患儿20例,年龄在2～10岁,以其基因组 DNA 为模板,通过 PCR反应,分别扩增 dystrophin 基因外显子及侧翼序列,采用变性高效液相色谱(DHPLC)技术进行突变筛查,对 DHPLC 峰形变异的外显子片段行 PCR 产物直接测序,确定突变的具体位点和类型。结果筛查了包括2个缺失热点区 dystrophin 基因的68个外显子和3′UTR 部分片段,分别在4例患儿中检测出该基因的4种致病突变:c.6808_6811delTTAA,c.4959_4960insA,c.8656C>T 和 c.8608C>T。前两例引起移码突变分别导致 p.Leu2270MeffsX9和 p.Ser1654LysfsX5,后两例为无义突变分别导致 p.R2886X 和 p.R2870X。其中 c.6808_6811delTTAA,c.4959_4960insA 和 c.8656C>T 为文献未曾报道的新突变。结论 DHPLC 可以作为有效地筛查 DMD 微小突变的检测方法。

dystrophin基因突变研究进展

Duchenne/Beckermuscu lar dystroph ies(DMD/BMD)是人类常见的X染色体连锁隐性遗传的神经-肌肉系统疾病,发病率高,至今尚无有效的治疗方法。DMD和BMD是等位基因异质性疾病,其候选基因dystroph in突变率高,有5′端和中央两个缺失热点区域,通过筛查缺失热点区域可以检出98%的缺失。DMD/BMD与dystroph in基因突变关系复杂,dystroph in基因突变导致DMD/BMD不仅与基因突变是否破坏了开放阅读框有关,而且与dystroph in蛋白受累的功能区域相关,并涉及“外显子跨越转录”和“阅读框重建”等保护性调节机制。

遗传性弥漫性胃癌相关基因表达及突变分析

目的研究遗传性弥漫性胃癌相关基因表达及突变,探讨遗传性弥漫性胃癌家系发病的分子遗传学机制。方法免疫组织化学S-P法检测该家系先证者胃癌组织中E-cadherin、β-catenin、SMAD4、TP53和ANXA10蛋白的表达情况,PCR扩增结合DNA测序筛查E-cadherin、SMAD4、P53和ANXA10基因的所有编码序列以及外显子-内含子交界处序列的种系突变情况。结果与先证者癌旁组织相比,癌组织中E-cadherin、SMAD4、TP53和ANXA10蛋白表达缺失,β-catenin表达降低。检测到SMAD4基因一个新的多态性位点即第1内含子24位碱基出现杂合性A>G的改变,E-cadherin基因和ANXA10基因只检测到一些已知多态,未发现种系突变,P53基因未发现任何突变。结论 E-cadherin、β-catenin、SMAD4和ANXA10蛋白异常表达,提示它们可能参与遗传性弥漫性胃癌家系的发病机制,但排除了E-cadherin、SMAD4和ANXA10基因外显子突变导致该病发病的可能性。

应用高通量测序技术检测一个Ⅰ型神经纤维瘤病家系基因突变

目的对1个I型神经纤维瘤病家系进行基因突变检测,为该家系成员提供遗传咨询并指导产前诊断。方法利用目标基因捕获和新一代高通量测序技术,对家系内1名症状典型患者N F 1基因编码区及其临近序列进行突变检测,对发现的可疑位点进行Sanger测序验证,并在家系内成员中验证所检测到的变异是否在家系内共分离。结果在该家系中,发现N F 1基因第18外显子存在一个微小插入突变c.2033dupC(p.Pro678Thrfs*22),进一步检测表明该突变在家系内与疾病表型共分离。结论 N F 1基因c.2033dupC突变是该家系的致病突变,针对致病基因编码外显子较多的遗传性疾病的检测,高通量测序技术具有显著优势。

DOC-1R基因重组表达载体构建及其在HeLa细胞中的表达

目的 构建人DOC-1R基因重组逆转录病毒表达载体,实现该基因在体外培养细胞中的大量表达,从而研究表达蛋白的功能。方法 通过重组技术将含有FLAG标签序列的DOC-1R cDNA编码区全长克隆至逆转录病毒载体pLXSN,菌落PCR鉴定、限制性内切酶双酶切及测序验证重组载体的构建。将重组载体转染至GP-293细胞进行病毒包装并以所包装的病毒感染HeLa细胞,通过Western blot及间接免疫荧光染色检测重组DOC-1R蛋白的表达及细胞内定位。结果 测序结果表明重组载体中插入的重组片段序列及开放阅读框架正确,逆转录病毒表达载体pLXSN-FLAG-DOC-1R成功构建。Western blot及间接免疫荧光染色结果证实,逆转录病毒介导的重组DOC-1R蛋白在HeLa细胞中高效表达,表达效率明显高于真核表达载体介导的重组蛋白表达。结论 DOC-1R基因逆转录病毒表达载体成功构建,重组蛋白在体外培养细胞正确高效表达。

有汗性外胚层发育不良一家系基因突变

目的 探讨有汗性外胚层发育不良家系的基因突变及突变类型，为建立本病的基因诊断与遗传咨询提供依据。方法 PCR及Sanger测序技术对有汗性外胚层发育不良家系先证者GJB6基因外显子进行突变鉴定，对可疑的变异位点， Sanger测序检测家系其他成员该位点变异情况。结果 基因检测结果表明，家系先症者GJB6基因错义突变c.31G〉A，该突变导致连接蛋白-30（connexin-30, CX-30）第11位氨基酸由甘氨酸变成精氨酸（p.G11R）。家系的患者均携带此变异，而家系表型正常的个体不携带此变异。结论 GJB6基因c.31G〉A（p.G11R）突变是该有汗性外胚层发育不良家系致病基因突变。

一个结节性硬化症家系致病基因新突变鉴定

目的结节性硬化症(TSC)是一种累及多系统的常染色体显性遗传病,以全身多种组织器官出现错构瘤样增生为主要特征,其致病基因为TSC1和TSC2基因,本研究旨在对一中国汉族结节性硬化症家系进行基因突变分析,以明确临床诊断并指导遗传咨询。方法设计PCR引物,扩增TSC1和TSC2外显子及外显子-内含子交界区并进行Sanger测序和片段克隆测序分析,确定突变位点并探讨突变致病的可能机制。结果 TSC1基因测序分析发现先证者第15外显子存在两个杂合突变,c.1556C>T和c.1888_1891del AAAG。克隆测序结果显示,先证者的两个突变均来自于同一个等位基因。第一个突变可能影响TSC1与粘着斑激酶家族作用蛋白FIP200的结合,第二个突变形成了提前的终止密码,推测可能形成截短的蛋白分子,或者通过无义介导的m RNA降解机制被降解而致病。结论TSC1基因c.1556C>T和c.1888_1891del AAAG为结节性硬化症家系致病突变,对患者明确诊断及遗传咨询有重要意义。

黑斑息肉综合征STK11基因突变分析

目的检测黑斑息肉综合征(PJS)家系丝氨酸/苏氨酸激酶基因11(STK11)基因突变,分析致病机制。方法提取家系中患者及正常人外周血基因组DNA,PCR扩增STK11全部外显子及其侧翼序列,扩增后产物纯化后直接进行DNA测序。结果该家系致病基因突变为STK11第1外显子杂合的碱基置换c.250A>T,为无义突变产生只有84个氨基酸的截短蛋白。结论该家系致病基因突变为c.250A>T(p.K84*),其致病机制为产生的截短蛋白缺失了大部分的激酶催化域,STK11活性下降的同时,p53的活性也明显下降。该致病基因突变具有较高的肿瘤易感风险,建议家系患者定期临床随访。

DOC-1R基因表达载体的构建及其重组蛋白的表达纯化

目的构建DOC-1R（deleted in oral cancer-1related）的原核表达载体并且纯化其重组蛋白，用于进-步研究DOC-1R蛋白的结构与功能。方法采用基因重组技术构建原核表达载体pGEX—DOC-1R，经DNA测序鉴定后，转化E．coliB[21，IFFG诱导表达并纯化融合蛋白。结果以菌落PCR及限制性内切酶酶切鉴定得到候选阳性克隆，测序结果表明所得到的克隆序列及开放阅读框架完全正确，IPTG诱导后SDS—PAGE电泳分析表明在40kD处出现特征蛋白表达带，经磁珠亲合层析后Western印迹检测证实得到较高纯度的GST—p14 DOC-1R融合蛋白。结论成功构建了pGEX—DOC-1R的原核表达载体，表达并纯化出GST—p14 DOC-1R融合蛋白，为DOC，1R抗体制备及研究DOC-1R蛋白结合蛋白及其在细胞周期调控中的生物学功能奠定了基础。

利用CRISPR/Cas9技术构建DOC-1R基因敲除的HEK-293稳转细胞系

目的利用CRISPR/Cas9技术敲除人胚肾(human embryonic kidney cell,HEK-293)细胞中DOC-1R,构建DOC-1R敲除的HEK-293稳转细胞系,用于进一步讨论DOC-1R的生物学功能。方法根据CRISPR/Cas9设计原则,设计向导RNA(single-guide RNA,sgRNA),构建表达载体,对sgRNA测序并转染包装HEK-293T收集上清液测定病毒滴度。前期用Cas9-puro慢病毒感染HEK-293,用已制备的DOC-1R慢病毒感染稳转Cas9的HEK-293,72 h后显微镜下观察HEK-293表达红色荧光蛋白,并用Western blot检测HEK-293中DOC-1R的表达以确定沉默效果。结果测序显示插入的sgRNA序列正确,表达载体成功构建,显微镜下观察到,90%以上HEK-293表达红色荧光蛋白,HEK-293中DOC-1R蛋白表达减少,确定了DOC-1R敲除效果最明显的序列为GCCTACCTATGCTGGCAGCA。结论利用CRISPR/Cas9技术成功构建DOC-1R基因敲除的细胞系,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。

强直性肌营养不良症1例

1病例报告 患儿女，9．6岁。以“握拳后双手展开困难2年”为主诉．2009—02—23于中国医科大学附属盛京医院发育儿科就诊。患儿近2年来发现握拳后双手放松困难，右手重于左手，天气寒冷及晨起时加重，活动后症状逐渐缓解患儿自幼双眼畏光，近2年双跟视力开始下降，