子宫内膜基质细胞作为饲养层培养人胚原始生殖细胞

目的探讨子宫内膜基质细胞作为饲养细胞培养人胚原始生殖细胞的可能。方法从5～9周人胚胎生殖嵴、中肾嵴、肠系膜中消化分离原始生殖细胞(PGCs),种植于经丝裂霉素C处理的人子宫内膜基质细胞饲养层上培养。结果PGCs可以在体外培养3个多月,传14代。这样培养的PGCs表达胚胎干细胞的多种标志,如碱性磷酸酶染色、SSEA和TRA抗原等。另外细胞保持正常的染色体核型。结论人子宫内膜基质细胞可以作为饲养细胞在体外培养人胚原始生殖细胞,保持未分化状态。

在人子宫内膜饲养层上生长的人原始生殖细胞生物学特性

背景:目前在胚胎多潜能干细胞建系和培养过程中,存在着建系率低、具有正常核型的干细胞系比率低等问题。目的:观察接种于人子宫内膜成纤维细胞饲养层上原代培养的人原始生殖细胞在体内外的生物学特性。设计、时间及地点:细胞观察,于2004-01/2005-04在沈阳市妇婴医院和中国医科大学完成。材料:人胚胎来源于流产孕妇,用于分离培养原始生殖细胞。人子宫内膜来源于因子宫肌瘤行子宫切除术的患者,用于制备成纤维细胞饲养层。清洁级10周龄雄性裸鼠2只,用于体内分化实验。方法:从人胚胎生殖嵴、肠系膜中消化分离的原始生殖细胞,将其接种在人子宫内膜成纤维细胞饲养层上传代培养。体内实验取连续传5代的2个细胞株,分别制备浓度为1×109L-1的细胞悬液,于每只小鼠两侧腹股沟处皮下各接种0.5mL,培养8周。体外分化采用无黏附特性的培养瓶和除去白血病抑制因子的原始生殖细胞培养液,以脱饲养层法悬浮培养扩增的细胞,直到拟胚体形成及贴壁分化。主要观察指标:通过免疫荧光检测胚胎干细胞特异性表面标志物的表达、碱性磷酸酶染色及染色体核型分析,对所培养细胞进行鉴定。检测裸鼠体内畸胎瘤的形成及组织分化。免疫组化染色观察体外肌肉特异性肌动蛋白、巢蛋白、广谱细胞角蛋白的表达。结果:①传至第2、7代的人胚胎原始生殖细胞SSEA-4,SSEA-3,TRA-1-60,TRA-1-81等表面标志物均呈阳性表达,碱性磷酸酶染色呈阳性,染色体分析为正常二倍体核型46XX。②接种8周末,2只小鼠均形成皮下畸胎瘤,其内存在囊括3个胚层的组织结构,包括皮脂腺、脂肪、腺体及腺上皮、鳞状上皮等。③培养第4天形成拟胚体,肌肉特异性肌动蛋白、巢蛋白、广谱细胞角蛋白均呈阳性表达。结论:人子宫内膜成纤维细胞可以作为人原始生殖细胞的饲养层细胞,传代后的原始生殖细胞仍保持胚胎干细胞的未分化状态和发育全能性。

先天性马蹄内翻足胎鼠脊髓组织的蛋白质组学分析

目的在构建动物模型的基础上,运用蛋白质组学实验方法,寻找马蹄内翻足畸形相关蛋白。方法提取单纯性马蹄内翻足畸形胎鼠及正常对照胎鼠脊髓总蛋白,进行双向电泳;经PDQuest软件分析,选择差异点进行质谱鉴定,采用生物信息学方法分析结果。结果经双向电泳分离后,畸形胎鼠与正常对照组相比,脊髓组织的烯醇化酶没有表达,微管蛋白表达下调,载脂蛋白表达上调,ATP合酶F1复合体组装因子2(Atp12p)额外表达。结论畸形胎鼠脊髓组织与正常对照组比较,存在蛋白质组差异,畸形胎鼠微管蛋白、Atp12p表达改变,可能与马蹄内翻足畸形相关。

PCR-DGGE法筛查PAH基因第6外显子突变——一种新的多态

为提高苯丙酮尿症的基因诊断率，应用聚合酶链反应－变性梯度凝胶电泳及自动测序检测了１２例苯丙酮尿症患者外周血ＤＮＡ，发现２种突变：Ｙ２０４Ｃ和Ｑ２３２Ｑ，其频率分别为１／２４和２／２４。结果显示Ｙ２０４Ｃ为中国北方人常见的突变之一，而Ｑ２３２Ｑ则为中国北方人中一种新的多态，这为辅助苯丙酮尿症的诊断提供了便利手段。