人肝脏辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶的表达与细胞内定位

应用杆状病毒蛋白表达系统在Sf9细胞中对人肝脏辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢／还原酶(NADP-dependent retinol dehydrogenase／reductase,NRDR)进行表达。以纯化的重组蛋白质为材料,分析NRDR的催化活性和酶促反应性质。结果证实,人肝脏NRDR具有视黄醛还原酶活性,在辅酶Ⅱ存在条件下其催化视黄醛还原成视黄醇的Km值和Vmax值分别(2.8±0.24)μM和(0.468±0.036)μmol／(min·mg)。构建删除和不删除羧基端过氧化物酶体定位信号SRL序列的NRDR绿色荧光蛋白报告基因表达载体。转染HeLa细胞后,应用免疫荧光双染色的方法分析NRDR细胞内定位。结果表明NRDR定位在细胞内过氧化物酶体。羧基端SRL序列对NRDR定位到过氧化物酶体是必需的,删除SRL序列的NRDR分布在细胞质中。因此,人肝脏NRDR是存在于过氧化物酶体中的辅酶Ⅱ依赖性视黄醛还原酶。

血管生长抑制因子angiostatin在昆虫细胞中的表达及活性研究

背景与目的:抑制新生血管的形成,有助于抑制肿瘤的生长,减少和预防肿瘤转移的发生。血管抑素(angiostatin)是一种重要的内源性新生血管生成抑制剂,对血管内皮细胞增殖有较强的抑制作用。为获得具有高活性的Angiostatin表达,本研究通过杆状病毒表达系统表达重组的angiostatin,分析其在昆虫细胞中表达和生物活性。方法:用带有angiostatin的杆状病毒转移载体pBlueBacHis2B和病毒DNA共同转染Sf9细胞,构建重组病毒,蚀斑实验筛选,PCR分析确定后扩增产生大量高滴度的病毒贮存液;用SDS-PAGE电泳和Westernblot对感染不同时间后分泌的重组蛋白做时间表达分析;用ProBondTM纯化系统对表达的重组angiostatin进行纯化,分光光度计确定蛋白含量,SDS-PAGE电泳确定蛋白纯度;采用MTT法测定重组蛋白angiostatin对原代培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的抑制作用而后通过鸡胚尿囊膜实验进一步证实其抗血管形成作用。结果:成功构建了滴度为2×108pfu/ml的angiostatin重组杆状病毒,并在昆虫细胞Sf9中高效表达了分子量为53ku的angiostatin重组蛋白,纯度约为90%,重组angiostatin蛋白不仅在体外显著抑制内皮细胞的生长(IC50为2.3μg/ml),而且显著抑制鸡胚尿囊膜血管的生长。结论:此系统可制备高滴度angiostatin重组杆状病毒贮存液,并在Sf9昆虫细胞中高效表达该重组蛋白,经在体和离体细胞学实验验证其对内皮细胞的增殖具有抑制作用。