神经干细胞移植对脊髓损伤后PLP基因表达的影响

目的: 研究神经干细胞(NSCs) 移植对大鼠脊髓损伤(SCI) 后髓鞘蛋白前脂蛋白(PLP) 基因表达的影响, 探讨神经干细胞移植促进大鼠SCI后髓鞘再生的机制。方法:NSCs由5-溴-2脱氧尿嘧啶核苷标记法(Brdu) 标记。实验分为3组: NSCs移植组(A组)、DMEM填充组(B组)、正常对照组(C组)。大鼠SCI后第7d移植NSCs, 应用免疫组化和RT-PCR法观察NSCs移植后是否存活, 以及大鼠脊髓损伤区PLP基因表达的动态变化。结果: NSCs移植后在受体脊髓内存活, NSCs移植组较单纯损伤组明显促进了PLP基因在分子和蛋白水平的表达。结论: NSCs移植后可存活并促进PLP基因的表达, 是促进脊髓损伤后髓鞘再生的机制之一。

大肠杆菌侵袭基因缺失突变株与人脑微血管内皮细胞的相互作用

ibeA、ibeB、ibeC是与大肠杆菌侵袭人脑微血管内皮细胞(HBMEC)密切相关的基因,但迄今各基因的功能并不清楚。应用侵袭分析和免疫荧光技术分析了各基因的缺失突变型及野生型大肠杆菌对HBMEC的侵袭、细胞骨架与细胞间紧密连接的影响。结果显示:野生型菌大肠杆菌侵袭率为3.46%,而ibeA、ibeB、ibeC缺失突变株分别为0.54%、0.82%和0.73%;ibeA缺失突变型与野生型大肠杆菌作用相似,可引起HBMEC的细胞骨架蛋白分布改变,在细胞膜处呈明显的聚集,而ibeB和ibeC缺失突变株并未引起细胞骨架的明显改变;野生型和ibeA缺失突变型大肠杆菌可引起紧密连接结构的明显改变,而ibeB和ibeC缺失突变株对紧密连接结构的影响不明显。这些观察到的结果提示:ibeB和ibeC基因产物可能在调节细胞骨架和影响细胞紧密连接中起重要作用,而ibeA基因产物在其中的作用较小。

大肠杆菌血脑屏障侵袭基因ibeB的稳定转染能够促进HeLa细胞片状伪足的形成

为进一步探讨大肠杆菌血脑屏障侵袭基因ibeB的生物学特性,将ibeB基因克隆至真核表达载体,采用稳定转染的方法,对ibeB基因在HeLa细胞中的表达所产生的影响进行了研究. 结果发现:经ibeB基因稳定转染的HeLa细胞向外周伸展,细胞骨架的组分——微丝发生了重新排布,形成了明显的片状伪足,细胞周边形成较多的膜皱褶结构;细胞对底物的粘附能力和伸展能力显著增强;细胞的粘着斑标志性蛋白Vinculin表达增强. 这些结果为研究片状伪足的形成机制提供了模型.

轻度认知功能障碍患者血小板脂质筏内胆固醇水平的研究

目的研究轻度认知功能障碍(MCI)患者血小板脂质筏内胆固醇水平的变化,为其早期诊断提供科学依据。方法选择51例MCI患者、40例AD患者和52例认知功能正常的健康对照者,分别进行神经功能评定,采用以Optiprep为介质的密度梯度离心方法分离血小板脂质筏,应用点印迹的方法进行鉴定后,采用荧光法测定其内胆固醇水平。结果在离心管25%~30%Optiprep溶液界面处可见一条白色的闪亮环带,经点印迹法证实,其为脂质筏。MCI组和AD组血小板脂质筏内胆固醇水平均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。MCI组血小板脂质筏内胆固醇水平低于AD组,差异有统计学意义(P<0.05)。MCI组血小板脂质筏内胆固醇水平与MoCA总分及MoCA评分中的延迟回忆、注意力和计算力、视空间与执行功能亚项呈显著负相关(P<0.05)。AD组血小板脂质筏内胆固醇水平与MMSE评分中的回忆能力呈显著负相关(P<0.05)。结论血小板脂质筏内胆固醇水平的改变在MCI的诊断中有一定的潜在价值,有望成为MCI和AD早期诊断和病情评估的重要生物学标记物。

宽频噪音对谷氨酸中毒损伤AD模型大鼠不同脑区NMDAR1(ζ1)、NMDAR2A(ε1)亚基表达的影响

目的 :观察AD大鼠模型颞叶和额叶在 98dB宽频噪音暴露 5min后不同脑区NMDAR1(ζ 1)、NMDAR2A(ε1)表达的影响。方法 :采用WesternBlot及RT PCR技术 ,结合ABR测定方法。结果 :①AD模型组大鼠、空白对照组大鼠在 98dB宽频噪音暴露 5min后额叶、颞区、海马及小脑NMDAR1(ζ 1)亚基表达无明显差异 ,但AD模型组表达明显弱于空白对照组 ;②生理盐水组加噪音后NMDAR1(ζ 1)亚基小脑表达最强 ,颞叶最弱 ;NMDAR2A(ε1)表达最强为颞叶 ,海马最弱。③在海马三组大鼠NMDAR1(ζ 1)、NMDAR2A(ε 1)亚基表达有较明显的下调趋势 ;④空白对照组大鼠NMDAR1(ζ 1)、NMDAR2A(ε1)亚基mRNA表达各区无差异。⑤AD模型组大鼠颞叶、海马NMDAR2A(ε 1)表达明显减弱 ,最弱为小脑 ,额叶次之。结论 :噪音刺激抑制AD大鼠模型海马NMDAR1(ζ 1)亚基表达 ,且不在mRNA水平。噪音刺激抑制AD模型大鼠颞叶、海马NMDAR2A(ε 1)亚基表达 ,且有部位差异 ,在mRNA水平已调节。

NRSE/RE-1 dsRNA诱导小鼠胚胎干细胞分化为NSE阳性的神经元样细胞

应用电打孔的方法将化学合成的NRSE/RE-1d sRNA转染小鼠胚胎干细胞,在去除LIF的条件下,直接接种培养,观察其分化情况,并对分化结果进行相关检测.结果显示分化细胞呈明显的神经样改变,免疫荧光显示NSE阳性率为(82.3±8.1)%.说明通过转染NRSE/RE-1d sRNA能有效地诱导小鼠胚胎干细胞向神经元细胞分化.

内质网应激条件下血管内皮细胞生长因子在人脑微血管内皮细胞中的表达

为观察内质网应激条件下血管内皮细胞生长因子的表达情况,用不同浓度的衣霉素处理体外培养的人脑微血管内皮细胞,建立内质网应激模型,采用RT-PCR、蛋白质免疫印迹以及免疫细胞化学的方法检测了细胞内血管内皮细胞生长因子的表达。结果发现血管内皮细胞生长因子在人脑微血管内皮细胞中存在一定的表达;内质网应激可诱导血管内皮细胞生长因子表达升高,随着衣霉素浓度的增高,血管内皮细胞生长因子的表达逐渐增加,与mRNA水平相比,血管内皮细胞生长因子蛋白量的增加更明显。实验结果提示人脑微血管内皮细胞中存在血管内皮细胞生长因子自分泌,血管内皮细胞生长因子可能是内质网应激的靶基因。

阿尔茨海默病患者血小板脂质筏内神经节苷脂GM1含量的研究

目的研究阿尔茨海默病(AD)患者血小板脂质筏内神经节苷脂GM1含量的变化,寻求一种可能作为辅助诊断AD的早期生物学指标。方法选择42例AD患者和45例认知功能正常的健康对照者分别进行神经功能评定,采用以Optiprep为介质的密度梯度离心方法分离血小板脂质筏,应用点印迹的方法进行鉴定后,采用BCA法测定血小板脂质筏内蛋白含量,比色法及点印迹定量分析法测定其内神经节苷脂GM1含量。结果在离心管25%~30%Optiprep溶液界面处可见一条白色的闪亮环带,经点印迹法证实,位于第6层的此白色闪亮环带即为脂质筏。AD组血小板脂质筏内蛋白含量略高于对照组,但差异无统计学意义(P=0.1494)。AD组血小板脂质筏内神经节苷脂GM1含量明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01),但其与年龄、MMSE评分无相关性。结论 AD组患者血小板脂质筏内神经节苷脂GM1含量与对照组相比明显升高,故血小板脂质筏内神经节苷脂GM1含量的改变在AD的诊断中有一定的潜在价值,有望成为一种辅助诊断AD的早期生物学指标。

压疮大鼠骨骼肌组织形态学变化研究

目的研究压疮大鼠缺血再灌注不同时间点骨骼肌的形态学变化。方法54只Wistar大鼠随机分为9组：对照组、缺血再灌注组（IR组）：IR0h组、IR4h组、IR12h组、IR24h组、IR3d组、IR1周组、IR2周组、IR4周组，每组6只。观察受压部位骨骼肌的大体形态及HE染色光镜下观察其病理改变。结果实验组大鼠骨骼肌结构发生进行性损伤，肌纤维出现溶解、断裂、空泡变、水肿、骨骼肌横纹消失、毛细血管扩张充血，间质水肿等病理改变。在施压后24h损伤最严重，施压后4周，仍未完全修复。结论压疮形成过程中受压部位骨骼肌的损伤是一个渐进的过程，在受压后不同时间损伤的表现不同。

大肠杆菌K1株毒力岛基因ibeT参与调节脑微血管内皮细胞骨架重排

目的探讨大肠杆菌K1株毒力岛基因ibeT与人脑微血管内皮细胞(HBMEC)骨架重排的关系。方法从大肠杆菌K1 E44中剔除侵袭基因ibeT,利用ibeT基因缺失突变株侵袭HBMEC 10 min后,再用罗丹明标记的毒伞素对细胞骨架进行染色,荧光显微镜观察。结果 E44与E44:△ibeT均能引起HBMEC的微丝发生重新分布。与E44相比,E44:△ibeT侵袭HBMEC的微丝向细胞周边延伸的程度较E44侵袭后的HBMEC弱,所形成的膜皱褶结构较少。E44侵袭细胞皮质区的肌动蛋白纤维基本消失,E44:△ibeT侵袭HBMEC细胞皮质区的肌动蛋白纤维仍然清晰可见。结论侵袭基因ibeT参与大肠杆菌K1侵袭HBMEC骨架重排。

化疗药物对大肠癌细胞CCL229抑制作用及诱导凋亡的研究

目的观察5-氟尿嘧啶(5-FU)、长春新碱(VCR)、司莫司汀(Me-CCNU)及5-氟尿嘧啶+长春新碱+司莫司汀在体外对大肠癌细胞CCL229的作用。方法MTT法观察药物对大肠癌细胞CCL229的抑制作用,用流式细胞仪和琼脂糖电泳方法检测细胞凋亡变化。结果联合用药组对CCL229的抑制率和诱导CCL229凋亡率均高于单独用药组。结论5-氟尿嘧啶、长春新碱、司莫司汀对大肠癌细胞CCL229均有抑制作用,联合应用比单独应用效果明显。

头孢曲松钠治疗大肠杆菌所致疾病机制的研究

目的探讨头孢曲松钠对大肠杆菌(E.coliK1)的作用机制。方法采用对照实验,培养E.coliK1至最佳状态,实验组细菌加入头孢曲松钠100μg,对照组加入生理盐水,孵育1h。通过western-blot方法检测E.coliK1外膜蛋白A的表达变化,软件分析蛋白表达灰度值。结果实验组OmpA与对照组比较,表达量明显下降。结论头孢曲松钠可以诱导E.coliK1的外膜蛋白A表达下降,从而影响E.coliK1外膜的完整性。

序贯培养法诱导小鼠胚胎干细胞向神经细胞分化的研究

目的诱导小鼠胚胎干细胞向神经细胞分化。方法通过"序贯培养法"诱导小鼠胚胎干细胞分化为神经细胞,并应用RT-PCR、免疫荧光、端粒酶活性及基因芯片等对诱导结果进行检测。结果分化细胞表达神经元特异性烯醇化酶(NSE)、低分子量神经微丝蛋白(NF-L)、神经细胞粘附分子1(NCAM1)、微管相关蛋白Tau等多种神经元标志物,免疫荧光显示NSE阳性率为(81±9.2)%,而神经胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)几乎不表达。基因芯片分析结果显示,在3张芯片中有8179个基因共表达,另有998个基因的表达完全不同,且有多种神经元基因的标志物表达明显升高。结论通过"序贯培养法"能有效地诱导小鼠胚胎干细胞向神经元分化。

大肠杆菌yijP侵袭蛋白诱导人脑微血管内皮细胞凋亡

为研究大肠杆菌的脑微血管内皮细胞侵袭基因yijP的功能,将yijP基因(1.04kb)克隆到pQE30表达载体,构建表达产物为N末端带有6个组氨酸(His)序列的yijP汇合蛋白,以M15(pREP4)为受体菌,大量表达(His)6-yijP汇合蛋白,利用Ni-NTA亲和层析纯化汇合蛋白,将经透析法复性的一定浓度的(His)6-yijP蛋白加入到体外培养的人脑微血管内皮细胞中,结果显示yijP蛋白对人脑微血管内皮细胞有较强的细胞毒作用:在相差显微镜下可观察到细胞皱缩、胞膜呈泡状膨出,随着时间延长细胞逐渐脱落;荧光显微镜下可见细胞核呈现为致密团块状或圆形浓染颗粒状,呈凋亡样改变;DNA琼脂糖凝胶电泳可见DNA阶梯状条带;流式细胞仪显示在正常二倍体峰之前出现一个亚二倍体峰;Western印迹可检测到caspase-3的活性片段。这些现象均出现在yijP蛋白作用于人脑微血管内皮细胞的16h之后,提示在大肠杆菌侵袭人脑微血管内皮细胞过程中,yijP蛋白可能起到诱导脑微血管内皮细胞迟发性凋亡的毒素作用。

iNOS在压疮大鼠骨骼肌中的表达及意义

目的研究iNOS在压疮大鼠骨骼肌中表达情况，探讨iNOS参与压疮发生的机制。方法54只Wistar大鼠随机分为9组：对照组、缺血再灌注组（IR组）：IROh组、IR4h组、IR12h组、IR24h组、IR3d组、IR1周组、IR2周组、IR4周组，每组6只。免疫组化法观察大鼠骨骼肌iNOS阳性纤维数量及形态学变化；免疫印迹法检测骨骼肌iNOS蛋白表达情况。结果实验组大鼠骨骼肌的结构发生进行性损伤，出现肌纤维溶解、断裂、空泡变、水肿、横纹消失、血管扩张充血、间质水肿等病理改变。以IR24h最为严重，此后逐渐缓解，至IR4周组织损伤仍未完全修复。在IR4h组、IR12h组、IR24h组、IR3d组中可见大量iNOS阳性表达的骨骼肌纤维，和对照组相比iNOS蛋白表达水平显著增高（P〈0．05）。IRl2h组、IR24h组iNOS表达水平最高。结论iNOS参与压疮的形成，其活化是压疮缺血再灌注损伤过程中自由基氧化损伤的重要环节。

高级细胞分子生物学技能实验教学的系统化改革实践

为适应细胞分子生物学领域实验技术的飞速发展，快速有效地培养研究生的实验技能，需要对高级细胞分子生物学技能实验教学进行系统化改革。教学中将基础理论、生物学实验与实际应用相结合，使学生系统掌握从取材到分子生物学分析以及构建体外转基因细胞模型所需的基本技术；增添临床案例剖析、模拟伦理审查等生动的课堂活动，提高了学生兴趣，培养了学生的团队协作能力；研究表明其教学效果很好，值得推广。

IVF短时受精补ICSI与其它受精方式临床结局的比较

【目的】比较短时受精补卵细胞胞质内单精子注射（ICSI）与短时受精、ICSI周期的临床应用结局。【方法】收集体外受精-胚胎移植（IVF-ET）的患者6897例，IVF短时周期4060例（A组），IVF短时补ICSI周期1177例（B组），ICSI周期1660例（c组），比较三组受精率、妊娠率及流产率。【结果】A组、B组、C组正常受精率分别为74．07％、69．08％、83．16％，三组比较差异有统计学意义（Pd0．05）；A组、B组、c组临床妊娠率、流产率分别为44．8％、11．1％，43．0％、11．9％，43．9％、10．9％，三组临床妊娠率、流产率比较均无统计学差异（P〉O．05）。【结论】短时受精补ICSI组的正常受精率低于短时受精、ICSI周期组，但体外受精的临床临床妊娠率及流产率无统计学差异，故短时受精补ICSI是辅助生殖值得采用的受精方法。

宫内暴露尼古丁对生后小鼠大脑皮层神经细胞凋亡的影响

目的研究宫内暴露尼古丁对生后小鼠大脑皮层神经细胞凋亡的影响。方法建立妊娠期宫内暴露尼古丁小鼠动物模型,观察生后21天小鼠大脑皮层组织结构变化,免疫组织化学方法和W estern b lot方法检测宫内暴露尼古丁模型大脑皮层caspase-3的表达。结果尼古丁组小鼠大脑皮层脑回厚度较对照组变薄(P<0.05),免疫组织化学法检测到大脑皮层caspase-3阳性反应物的平均光密度值在尼古丁组高于对照组(P<0.05),W estern b lot方法检测到大脑皮层caspase-3酶原(32KD)形式及活性片段形式(17KD、20KD)的相对表达量高于对照组(P<0.01)。结论孕期宫内暴露尼古丁激活生后小鼠大脑皮层神经细胞caspase-3的过表达,参与大脑皮层神经细胞凋亡。