组织工程学实验教学改革初探

组织工程学是一门新兴的边缘交叉学科,是生命科学与工程学相结合的产物.其主要目的是研究和开发人体组织器官的替代物,修复人体组织或器官的缺损,帮助患者恢复劳动能力,提高生活质量.近10年来组织工程学得到了突飞猛进的发展,世界上许多大学和研究机构,都专门建立了组织工程的研究和教学平台.培养一批掌握组织工程技术的专门人才,紧跟科学前沿,开拓进取,锐意创新,为推动组织工程学的发展,造福人类健康服务[1].

以“卓越工程师”为目标的生物医学工程专业课程体系改革

本文总结了中国医科大学生物医学工程专业的教学方式,阐述了中国医科大学生物医学工程专业在培养目标与培养要求、课程体系、教学内容、教学方法、实践教学、教学团队建设、培养机制等方面的改革,并分析了相关改革效果,指出以"卓越工程师"为目标的课程体系改革能够提升学生的综合素质和就业质量。

bulge区毛囊组织块培养结合酶消化法分离大鼠毛囊隆突部细胞的生物学特征

背景：目前毛囊隆突部细胞的分离培养方法多存在细胞分离纯度不高、活力差等缺点，采用组织块法和酶消化法分离培养大鼠毛囊隆突部细胞能否克服上述缺点？目的：本实验采用组织块法和酶消化法分离培养大鼠毛囊隆突部细胞并对其进行鉴定。设计、时间及单位：单一样本设计，体外细胞培养实验。于2007—03／08在中国医科大学组织工程学实验室完成。材料：选用15只雌性Wistar大鼠，由中国医科大学实验动物中心提供。实验用表皮生长因子、Hoechst33342购白美国Sigma公司，SAB-小鼠IgG抗体免疫组化试剂盒、SABC—Cy3免疫荧光组织化学试剂盒、DAB显色剂、SABC—FITC免疫荧光组化试剂盒均购白武汉博士德公司。方法：利用显微分离的方法将大鼠触须部皮肤分离，剪开真皮和皮下组织，将毛囊与周围组织钝性分离取出毛囊，剪开结缔组织鞘，用显微外科镊取出毛囊外根鞘bulge区，移入培养板中进行组织块培养，应用0．25％胰酶＋0．02％EDTA消化分离大鼠毛囊bulge区细胞，倒置相差显微镜下观察其增殖能力，免疫荧光法检测毛囊隆突部细胞K15、β1整合索和P63的表达情况。主要观察指标：①大鼠隆突部细胞增殖能力。②毛囊隆突部细胞K15、β1整合索和P63的表达。结果：①大鼠隆突部细胞胞体积较大，胞核大，核仁明显，细胞生长迅速，活力好，3-4d即可传代，具有增殖能力强、细胞纯度高等特性。②细胞免疫荧光结果显示培养的细胞胞浆角蛋白15阳性，细胞的胞膜β1整合索阳性，细胞的胞核P63阳性。结论：组织块法结合酶消化法可成功分离培养毛囊隆突部细胞，细胞可同时表达K15、β1整合索和P63，纯度高，活力好。

表皮干细胞在糖尿病创面愈合过程中的动态变化

目的 观察糖尿病（diabetes mellitus，DM）大鼠创伤后不同时期表皮厚度、表皮干细胞（epidermalste mcells，ESCs）数量变化和分布特征及创面愈合率等动态变化，探讨ESCs与DM皮肤创面难愈之间的关系。方法 48只Wistar大鼠，雄性，体重180～200g。随机分为DM组和正常对照组，各24只。DM组大鼠制备DM大鼠慢性创面愈合模型。两组大鼠同时用特制打孔器在大鼠背部脊柱两侧约1．5cm制作直径1．8cm、面积2．54cm。的全层皮肤缺损（共计96个创面），分别在致伤后第3、7、14和21天拍摄创面，计算创面愈合率；取创缘及肉芽组织，行HE染色及角蛋白19（keratin19，K19）和β1整合素抗体免疫组织化学染色，显微图像分析系统测量表皮厚度、阳性部分面积及灰度值。结果 致伤后第3、7、14和21天，正常对照组大鼠创面愈合率分别为24．48％±3．37％、50．46％±1．26％、92．82％±2．12％和99．41％±0．66％，而DM组分别为2．43％±1．02％、40．59％±1．65％、80．77％±3．57％和85．40％±0．94％，两组同时期比较差异有统计学意义（P〈0．01）。致伤后第3、7、14和21天，正常对照组表皮厚度分别为26．43±3．21、33．29±3．52、31．53±3．35和26．01±3．19p．m，DM组表皮厚度分别为23．58±2．33、31．02±3．38、33．72±5．49和21．80±4．02p．m，致伤后第3、21天，二者比较差异有统计学意义（P〈0．01）。致伤后第3、7、14和21天，正常对照组K19染色的平均阳性单位（positiveunit，PU）值分别为91．68％、93．14％、72．27％和70．31％，而DM组分别为40．29％、40．79％、29．94％和10．37％；正常对照组β1整合素染色的平均PU值分别为49．60％、91．16％、77．13％和57．17％，DM组分别为38．94％、24．16％、61．36％和38．83％，与正常对照组同时期比较，DM组K19和β1整合素染色的平均PU值都降低，且差异有统计学意义（P〈0．05）。结论 ESCs数量少和活性低可能是DM创面难愈的重要机制之一。

TAT-Apoptin融合蛋白分泌表达载体的构建及其活性检测

目的构建具有自主跨膜能力的Apoptin融合蛋白表达载体,使其分泌表达,避开包涵体复性,简化制备工艺。方法人工合成反式激活蛋白(TAT)序列,与Apoptin序列融合,连接到pET22b+载体上,构建原核分泌表达载体pET22b+-TAT-Apoptin,IPTG诱导目的蛋白分泌表达到大肠杆菌周质空间,提取蛋白行SDS-PAGE分析,MTT法检测分泌表达的融合蛋白对胃癌823细胞的抑制作用。结果重组TAT-Apoptin蛋白可分泌至大肠杆菌周质空间中,以可溶状态存在,对胃癌823细胞的最大抑制率为83.95%。结论成功构建重组TAT-Apoptin蛋白表达载体,分泌表达的可溶性融合蛋白具有生物活性。

瑞舒伐他汀对急性冠状动脉综合征合并心律失常患者炎性因子变化的影响

目的观察瑞舒伐他汀对急性冠状动脉综合征(ACS)合并心律失常患者炎症和凋亡反应的作用。方法选择ACS患者171例,按是否合并心律失常分为心律失常组(83例)和对照组(88例),予瑞舒伐他汀10mg每日睡前顿服,治疗2周。治疗前后分别检测人高敏C反应蛋白(hs-CRP)、肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-1β基因以及Bcl-2和C-myc蛋白表达水平。结果两组间性别构成、年龄、疾病构成、合并疾病、治疗情况及治疗前后一般生化指标的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。治疗前,对照组的hs-CRP、TNF-α和IL-1βmRNA表达及C-myc蛋白表达水平均显著低于心律失常组(P值均<0.05),Bcl-2蛋白表达水平均显著高于心律失常组(P值均<0.05)。治疗2周后,两组的hs-CRP、TNF-α和IL-1β mRNA表达及C-myc蛋白表达水平均显著降低(P值均<0.05),Bcl-2蛋白表达水平均显著升高(P值均<0.05),两组间上述指标的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。结论 ACS合并心律失常患者的炎症和凋亡反应明显,可能是心律失常发生和持续的原因。瑞舒伐他汀具有抗炎、抗凋亡作用,可能与其治疗心律失常的作用相关。

高脂饮食对大鼠胸主动脉瘤形成过程中细胞黏附分子表达的影响

目的探讨高脂饮食对胸主动脉瘤形成过程中细胞黏附分子包括血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)表达的影响。方法将30只成年雄性Wistar大鼠随机分为3组,即对照组、手术组和高脂饮食组,采用氯化钙(CaCl2)诱导法制备胸主动脉瘤模型,于术后4周取外敷CaCl2段胸主动脉。采用地衣红染色和HE染色观察胸主动脉形态学改变;免疫组织化学技术检测CD45、VCAM-1和ICAM-1的表达。结果高脂饮食组动脉管径较手术组扩张明显,动脉管壁破坏更广泛,伴有更多的炎性细胞浸润;VCAM-1、ICAM-1较手术组表达升高。结论高脂饮食可促进胸主动脉瘤管壁VCAM-1和ICAM-1的表达。

血管内皮生长因子和血小板反应蛋白-1在大鼠胸主动脉瘤中的表达

目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)及血小板反应蛋白-1(TSP-1)在实验性大鼠胸主动脉瘤中的表达及其意义。方法 30只成年雄性Wistar大鼠随机分为对照组和手术组,每组15只。采用氯化钙(CaCl2)诱导法制备胸主动脉瘤模型,于术后4周取外敷CaCl2段胸主动脉。HE染色及地衣红染色观察胸主动脉组织学改变;免疫组织化学和免疫印迹法检测动脉瘤壁VEGF和TSP-1的表达。结果免疫组织化学显示,VEGF主要表达于动脉瘤中膜和外膜,而对照组表达很弱;TSP-1表达于正常动脉全层,而动脉瘤表达很弱。免疫印迹法显示,动脉瘤组织中VEGF表达均强于对照组,而TSP-1弱于对照组。结论 VEGF和TSP-1均参与胸主动脉瘤的形成,其可能是胸主动脉瘤新生血管生成的关键决定因素。

脱细胞技术及其在组织工程中的应用研究进展

目的对获取组织细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的脱细胞方法及脱细胞ECM支架在组织工程领域的应用进行综述。方法查阅近年国内外相关文献,对脱细胞方法进行归纳和分类,分析灭菌方法对脱细胞支架的影响,提出脱细胞程度的评价标准,总结脱细胞ECM支架在不同组织器官中的应用。结果脱细胞方法主要有物理法、化学试剂法和生物制剂法,不同的脱细胞方法对细胞去除程度及ECM成分的影响不同,需要根据组织和脱细胞方法的特点选择最佳脱细胞方法,以达到理想效果。结论选择合适的脱细胞方法对制备组织工程所需的生物材料非常重要。

动物低氧实验箱自动控制系统的组建及其在缺氧缺血脑损伤动物模型制作中的应用

目的组配低氧实验箱测氧装置的自动反馈调节系统,构建完整恒稳的氧浓度自动调节机制,并利用其进行缺氧缺血脑损伤(HIBD)大鼠模型的制作。方法购买电子控氧仪,自制气体密闭箱,自主选配组合气体控制阀门和自动感应开关。连接高压氮气,使氮气经电磁控制阀门进入密闭箱;控氧仪测得的密闭箱内的氧浓度信号被输出传至电磁感应开关,后者根据设定的氧浓度阈值控制电磁阀门的通断,进而控制氮气的通入或停止,达到维持密闭箱内的氧浓度恒稳状态。利用该自动控制系统,处理7 d龄颈总动脉结扎术后新生大鼠,设定并调节密闭箱氧浓度为(8.4±0.4)%,持续2.5 h。动物处理后于不同时间点取脑组织,记录表观损伤程度后取材保存,然后利用Western blot及免疫组化方法检测处理后脑组织内分子表达。结果该系统可以稳定调控密闭箱内的氧浓度于设定范围内。颈总动脉结扎术后7 d龄大鼠,于缺氧箱中处理2.5 h后,存活率达80%～90%。动物脑组织及细胞内分子表达发生明显改变,效果明显。结论该低氧试验箱的氧浓度自动控制系统达到了较好程度的稳定性,适于进行缺氧缺血脑损伤动物模型的制作实验。

慕课人体解剖学

信息高速公路的飞跃发展,网络技术的发展与覆盖,大数据时代的到来,为医学基础课的改革提供了坚实的发展与改革的平台,使大规模网络公开课（massive open online courses,MOOC）即慕课[1]这一新的教学模式应运而生,并成为基础医学教学方式与方法改革的不可阻挡的大趋势.“慕课”（MOOC）指的是大规模网络公开课.

Wistar大鼠胰岛细胞体外分离、纯化及鉴定(英文)

目的探索Wistar大鼠胰岛分离纯化的最佳条件。方法采用肝胰管内灌注胶原酶消化分离胰岛及Ficoll 400密度梯度离心纯化。纯化后的胰岛经组织学染色、电镜及放射免疫法鉴定其特异性和活力。结果组织学染色显示纯化后胰岛的活力和纯度分别在95%和85%以上。电镜显示纯化后的胰岛形态完整,包膜清晰,分泌颗粒丰富。放射免疫结果表明,低糖组和高糖组分泌胰岛素的浓度有显著差异,证明胰岛功能良好。结论肝胰管内灌注胶原酶消化法是一种好的消化方法。影响胰岛收获量的因素很多,例如胰腺的充分扩张,胶原酶的浓度和活性以及消化的时间等。

镁合金表面含硅涂层对成骨细胞的黏附、形态和细胞周期的影响

目的：评价成骨细胞在镁合金表面含硅涂层上的生长状况,为研究镁合金表面含硅涂层与成骨细胞的生物相容性提供实验依据.方法：用胶原酶消化法分离培养大鼠成骨细胞,并用免疫荧光和碱性磷酸酶染色法进行鉴定;然后将处于对数生长期的大鼠成骨细胞接种于材料表面,用扫描电镜观察成骨细胞在不同表面上粘附形态的变化,同时制备材料浸提液,用浸提液法培养细胞,并通过倒置相差显微镜观察细胞形态;用流式细胞仪检测成骨细胞的细胞周期变化.结果：分离出了大鼠成骨细胞,I型胶原免疫荧光显色及碱性磷酸酶显色阳性;成骨细胞与材料进行复合培养后,涂层组的成骨细胞生长活力旺盛、形态饱满、分布均匀,而单纯镁合金组未见细胞生长;硅含量为1%～5%涂层组的成骨细胞G2期＋S期所占百分比最高.结论：镁合金表面含硅涂层与成骨细胞具有良好的相容性,有利于细胞的黏附、生长和增殖.

RNA干扰介导的端锚聚合酶1表达下调诱导人神经母细胞瘤细胞的凋亡

目的探讨RNA干扰(RNAi)介导的端锚聚合酶1(TNKS1)的表达下调对人神经母细胞瘤(NB)细胞SH-SY5Y体外增殖能力和凋亡的影响及机制,为开发治疗NB的新靶点提供一定的实验基础。方法根据TNKS1基因序列,设计合成3个TNKS1基因的特异性短发夹环(shRNA)干扰片段,利用慢病毒作为载体,构建目的基因的RNAi序列。慢病毒感染SH-SY5Y细胞,实时定量PCR(Real-time PCR)法检测TNKS1基因的表达,筛选出最佳干扰序列进行后续实验。然后进行克隆形成实验,检测RNAi-TNKS1后细胞增殖能力的改变。并进一步用Western blotting法检测抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Caspase-3、Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)通路的关键蛋白β-catenin及其下游靶蛋白Cyclin D1和c-Myc的表达,最后用透射电镜观察凋亡形态的改变,探讨RNAi-TNKS1对细胞凋亡的影响及其作用机制。结果慢病毒载体构建成功,病毒滴度为5×1011TU/L。Real-time PCR检测结果显示,#3 shRNA为最佳的有效靶点。克隆形成实验的结果显示,RNAi-TNKS1后SH-SY5Y细胞的克隆形成率较对照组明显下降。Western blotting结果显示,RNAi-TNKS1可显著抑制Bcl-2蛋白的表达,促进Caspase-3蛋白的表达。此外,Wnt/β-catenin通路的关键蛋白β-catenin及其下游靶蛋白Cyclin D1和c-Myc的表达也降低。透射电镜结果显示,RNAi-TNKS1后细胞呈现明显的凋亡结构和形态。结论 RNAi介导的TNKS1的表达下调可降低SH-SY5Y细胞的体外增殖能力,诱导其凋亡,可能部分是通过抑制Wnt/β-catenin通路发挥作用。

胰岛素分泌细胞移植治疗Ⅰ型糖尿病的研究进展

Ⅰ型糖尿病(type Ⅰ diabetes mellitus,T1DM)是目前严重危害人类健康的常见病、多发病,全世界约有2%～5%的人患有此种疾病,且呈逐年增长趋势,多见于儿童和青少年.从降糖药物到胰岛素,从胰腺移植到胰岛移植,T1DM的治疗经历了一个漫长的过程.近年来研究发现,由胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESC)、胰腺干细胞及其它组织干细胞等诱导分化为胰岛素分泌细胞(insulin-serecting cells,ISC),可望解决移植过程中存在的供体不足的问题.着重介绍了几种ISC的来源和诱导分化途径,分析了各种途径的优势及不足.

姜黄素对大鼠胸主动脉瘤Bcl-2和Bax表达的影响

目的探讨姜黄素对大鼠胸主动脉瘤形成过程中Bcl-2和Bax表达的影响。方法将30只成年雄性Wistar大鼠随机分为3组,即对照组、动脉瘤组和姜黄素治疗组。采用氯化钙(CaCl2)诱导法制备胸主动脉瘤模型,术后4周取材。HE染色及地衣红染色观察胸主动脉组织学改变;免疫组织化学和Western blotting方法检测动脉瘤壁Bcl-2和Bax的表达。结果姜黄素可明显抑制胸主动脉的扩张。与对照组比较,动脉瘤组Bax表达水平明显升高,Bcl-2表达水平降低,姜黄素能有效降低动脉瘤中Bax的表达,升高Bcl-2表达水平。结论姜黄素可以促进胸主动脉瘤Bc1-2蛋白的表达,抑制Bax蛋白的表达,降低Bax/Bcl-2的比值。

姜黄素对大鼠胸主动脉瘤JNK信号通路的影响

目的：探讨姜黄素对大鼠胸主动脉瘤形成过程中JNK信号的影响。方法：成年雄性Wistar大鼠随机分为对照组、动脉瘤组和姜黄素治疗组。采用氯化钙（CaCl2）诱导法制备胸主动脉瘤模型,术后4周取材。H-E染色及地衣红染色观察胸主动脉组织学改变;免疫组织化学检测动脉瘤壁p-JNK和p-c-Jun的表达。结果：姜黄素可明显抑制胸主动脉的扩张。与对照组比较,动脉瘤组p-JNK和p-c-Jun表达水平明显升高,而姜黄素能有效抑制动脉瘤中JNK和cJun的磷酸化。结论：姜黄素抑制胸主动脉瘤的发展有可能与其抑制JNK信号相关。

间歇低氧促进大鼠动脉粥样硬化机制的研究

目的观察间歇低氧时大鼠血管平滑肌屏氧酶1(PON1)和Rho激酶的表达,探讨间歇低氧与动脉粥样硬化(AS)之间关系的分子机制。方法将4组雄性Wistar大鼠分为常氧(A)组、间歇低氧(B)组、间歇低氧+瑞舒伐他汀(C)组和间歇低氧+法舒地尔(D)组,并设立正常对照(E)组,30 d后行血脂、体质量、形态学检测,RT-PCR检测PON1和Rho激酶mRNA表达,并检测PON1和Rho GTPases活性。结果与E组对比,A、B、C、D组大鼠血脂均显著增高,主动脉内膜增生明显,PON1表达水平及活性显著降低,Rho激酶表达及Rho GTPases活性显著增加;与A组对比,B组大鼠血脂无显著差异,主动脉内膜增生显著增加,PON1表达水平及活性显著降低,Rho激酶表达及Rho GTPases活性显著增加;与B组对比,C组大鼠血脂显著降低,D组大鼠血脂无显著差异,但主动脉内膜增生均明显改善,C组PON1表达及活性显著增加,D组PON1表达及活性无显著差异,但C、D组Rho激酶表达及Rho GTPases活性均显著降低,且2组间无差异。结论间歇低氧可促进AS发生,PON1及Rho激酶激活与之密切相关。

经鼻内途径移植骨髓间充质干细胞治疗脑损伤:还有多少问题待验证?

背景:动物实验发现骨髓间充质干细胞移植后可促进脑损伤的修复。目的:综述经鼻内途径移植骨髓间充质干细胞到颅内的现状。方法:应用计算机检索1999年1月至2014年1月PubMed相关文章,检索词为"bone marrow mesenchymal stem cell,brain injury,transplantation",并限定文章语言种类为English。同时计算机检索1999年1月至2014年1月万方数据库相关文章,检索词为"骨髓间充质干细胞、脑损伤、移植",并限定文章语言种类为中文,最终纳入符合标准的文献38篇。结果与结论:近年来,较多的研究证实骨髓间充质干细胞移植能明显改善脑损伤模型动物的脑神经功能。许多研究者对移植的方法和途径进行了细致的研究和探索,并取得了多方面的进展。文章比较了骨髓间充质干细胞进入颅内的不同移植途径,重点从鼻黏膜的处理、移植入脑的路径、干细胞的标记与颅内观察、动物实验4个方面对经鼻内移植的途径进行了介绍,可见经鼻内途径将骨髓间充质干细胞移植到颅内,作为一种非侵袭性移植方法是具有广阔应用前景的。