乳腺导管非典型增生上皮细胞的超微结构研究

目的 :观察乳腺导管单纯性增生、非典型增生、乳腺癌细胞超微结构特点 ,研究乳腺导管非典型增生上皮细胞恶性转化过程中的形态结构特点及变化规律。方法 :应用透射电子显微镜观察乳腺增生症 2 0例 (其中导管单纯性增生 4例 ,轻度非典型增生 5例 ,中度非典型增生 5例 ,重度非典型增生 6例 )及乳腺癌 10例细胞的超微结构。结果 :乳腺导管非典型增生上皮超微结构变化介于单纯性增生及乳腺癌细胞之间 ,表现为微绒毛紊乱 ,数量减少。细胞间缝隙连接、镶嵌连接及桥粒数量减少及结构发育不良。细胞器数量增多 ,但发育不全。细胞核增大不规则 ,染色较深 ,增生细胞间可见肌上皮细胞。这些改变与乳腺导管单纯性增生、乳腺癌组织明显不同 ,但重度非典型增生细胞改变接近癌细胞。结论 :乳腺导管非典型增生细胞是从良性向恶性过渡的中间细胞 ,重度非典型增生细胞超微结构接近乳腺癌细胞 ,说明这些细胞已具备潜在的恶性趋势。要从整体形态分析 。

p73在骨巨细胞瘤中表达的意义

目的 :研究p73蛋白在骨巨细胞瘤中的表达 ,探讨其在骨巨细胞瘤发生、发展中的可能作用。方法 :应用免疫组化S P法检测 40例骨巨细胞瘤石蜡标本中p73蛋白的表达情况。结果 :p73在骨巨细胞瘤中表达阳性率为 30 .0 % ,对照组骨软骨瘤表达阳性率为 2 0 .0 % ,两组相比无显著差异 (P >0 .0 5 )。p73在骨巨细胞瘤Ⅰ～Ⅱ级组表达阳性率为 17.9% ,Ⅲ级组为 5 8.3% ,二者相比差异显著 (P <0 .0 5 )。结论 :p73在Ⅲ级骨巨细胞瘤中表达明显增高 ,提示其在骨巨细胞瘤发生、发展中可能发挥重要作用 ,并可作为骨巨细胞瘤Jaffe分级的辅助指标之一。

CUEDC2通过活化PI3K/Akt信号通路促进乳腺癌细胞的生长

目的:探讨CUE结构域2(CUE domain-containing 2,CUEDC2)蛋白在人乳腺癌细胞中的生物学作用。方法:人乳腺肿瘤细胞MCF-7转染的Myc-CUEDC2真核表达载体,提取转染细胞的总蛋白检测磷酸化Akt和总Akt的表达变化。利用CCK-8检测过表达CUEDC2后MCF-7细胞的生长。结果:CUEDC2能够活化Akt,使磷酸化Akt表达增加,能够促进人乳腺癌细胞生长。结论:当乳腺癌中CUEDC2表达增高时,能够引起PI3K/Akt信号通路活化,促进肿瘤细胞生长。

CUEDC2通过上皮-间质转化促进人乳腺癌MCF-7细胞侵袭转移

目的:探讨CUE结构域2(CUE domain-containing 2,CUEDC2)蛋白对人乳腺肿瘤细胞侵袭转移的作用机制。方法:人乳腺肿瘤细胞MCF-7转染的Myc-CUEDC2真核表达载体,提取转染细胞的总蛋白和总RNA进行蛋白免疫印迹和实时定量PCR检测上皮-间质转化(EMT)标志物上皮-钙黏蛋白(E-cadherin)和转录因子SLUG的表达。结果:过表达CUEDC2蛋白能够下调E-cadherin蛋白和基因的表达,而上调转录因子SLUG基因和蛋白的表达。结论:CUEDC2可能参与调节乳腺肿瘤细胞发生上皮-间质转化,促进乳腺肿瘤侵袭转移的发生,CUEDC2可能是人乳腺肿瘤侵袭转移的治疗靶点。

鼠骨折愈合过程中膜内化骨和软骨内化骨的细胞组织学变化

目的:观察骨折不同的愈合修复阶段中膜内化骨和软骨内化骨等细胞组织学变化.方法:利用鼠股骨闭合性骨折模型,取骨折后3～17 d骨痂标本,染色观察新生小梁骨、软骨、软骨内骨化和骨重建等细胞事件变化.结果:骨折后3 d出现膜内化骨,7 d出现成熟小梁骨,3～5 d出现软骨形成,7～9 d出现软骨内化骨,7～9 d出现骨小梁重建.结论:骨折愈合过程中存在高度有序的细胞组织形态学的变化.骨痂内的膜内化骨,软骨形成,软骨内化骨和骨重建等过程可同时或连续出现.

VEGF在类风湿关节炎病人骨小梁成骨细胞中的表达及意义

目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)在类风湿关节炎(RA)病人成骨细胞中的表达及作用机制。方法切取RA病人和外伤对照组病人股骨粗隆部松质骨块,采用免疫组织化学染色方法检测VEGF及其受体Flt-1和Flk-1在骨小梁成骨细胞中的蛋白表达。结果RA病人骨质疏松明显,骨小梁成骨细胞数目减少。RA组和对照组骨小梁成骨细胞同时表达VEGF及其受体Flt-1和Flk-1,但RA组表达明显减弱。结论血管源性因子VEGF以自分泌作用方式调节生理和病理状态下成人成骨细胞的表达,RA病人骨质疏松与VEGF作用减弱密切相关。

MiR-21下调SPRY2表达对多发性骨髓瘤细胞增殖和侵袭能力的影响及其机制研究

目的:探讨miR-21下调SPRY2基因表达在多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)发生发展以及转移过程中的作用。方法:构建miR-21表达载体LV-anti-miR-21及脂质体转染法筛选稳定沉默SPRY2的MM细胞系。应用实时定量PCR和Western blot检测miR-21表达和SPRY2蛋白表达水平。四甲基偶氮唑蓝法(MTT法)检测细胞增殖能力;流式细胞仪分析细胞周期;划痕实验检测细胞迁移能力;Transwell实验检测细胞侵袭能力。结果:实时定量PCR及Western blot检测结果表明:转染U266细胞后,U266/LV-anti-miR-21慢病毒MOI 20组和MOI 40组miR-21表达量较U266/un组差异明显下降(P<0.05);转染miR-21 mimics组的U266细胞SPRY2的蛋白表达量较无转染组(untreated)和阴性对照组(siRNA)明显降低,差异均具有统计学意义(P<0.01)。与无转染组、阴性对照组相比:MTT法显示转染组48、72、96h细胞的生长速度明显减慢,增殖率明显下降(P<0.01);流式细胞术表明miR-21 mimics转染U266细胞48、72h后,细胞凋亡率分别为U266组[(24.7±1.97)%、(38.6±1.56)%]、siRNA组[(27.3±1.72)%、(37.3±1.59)%]和U266/miR-21组[(12.7±1.27)%、(22.1±1.63)%],与两对照组比较,U266/miR-21组细胞凋亡率明显降低,G0/G1期细胞明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。划痕实验显示转染组24、48h细胞迁移的能力明显减弱(P<0.05);Transwell实验证实转染组48、72h细胞穿过聚磷酸酯膜的U266细胞数明显减少,细胞穿膜能力明显降低(P<0.05)。结论:MiR-21下调SPRY2基因表达能够在体外条件下促进MM细胞的增殖和侵袭作用,揭示其在MM的发生、发展及转移过程中的作用及可能的机制,为确立新分子靶向治疗提供可靠的研究依据。

血管内皮生长因子在新生鼠胫骨生长板软骨细胞中的表达

目的:探讨血管内皮生长因子(VEGF)在鼠生长板软骨细胞增殖、分化和矿化过程中的自分泌作用。方法:新生鼠(1～2d)10只,切取干骺部软骨组织,采用免疫组织化学方法(5只)和RT-PCR方法(5只),检测VEGF及其受体Flt-1和KDR/Flk-1在胫骨生长板中的表达。结果:免疫组织化学染色VEGF、Flt-1和KDR/Flk-1在生长板的上肥大区、下肥大区和矿化区中的软骨细胞表达强阳性,在增殖区少数软骨细胞中呈阳性表达,在静止区软骨细胞中表达阴性。RT-PCR检测的5只鼠中除1只不表达Flt-1外,VEGF(251 bp)、Flt-1(272 bp)和KDR/Flk-1(252 bp)在软骨组织中均清晰表达。结论:VEGF及受体Flt-1和KDR/Flk-1在生长板软骨中的表达具有高度一致性,并且随着软骨细胞的分化成熟表达逐渐增强。提示VEGF在生长板软骨细胞的增殖、分化和矿化过程中,可以自分泌作用方式起重要调节作用。

VEGF在新生鼠胫骨上端成骨细胞中自分泌作用的研究

目的: 探讨血管内皮生长因子(VEGF)在鼠成骨细胞中的自分泌作用。方法:切取新生鼠胫骨上端组织,采用免疫组织化学染色方法,检测VEGF及其受体Flt -1和KDR/Flk -1在新生鼠胫骨上端成骨细胞中蛋白质的表达。结果:免疫组织化学染色证实新生鼠胫骨上端中的成骨细胞同时表达VEGF及其受体Flt -1和KDR/Flk- 1。结论:作为一种重要的血管性因子,VEGF的自分泌作用方式在成骨细胞的分化中起重要作用。

GST-hCAP融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达

目的:构建GST标签的人c-Cbl相关蛋白(GST-hCAP)融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导其表达。方法:从COS-1细胞中提取mRNA,反转录为cDNA。用PCR方法扩增出hCAP基因全长,通过EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点将其定向插入pGEX-5X-1载体中,构建原核表达质粒pGEX-5X-1-hCAP,并转化E.coli DH5α,通过限制性内切酶酶切电泳和DNA测序鉴定正确后,转入E.coli BL21中,经异丙基硫代β-D半乳糖苷大量诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定。结果:酶切电泳及测序结果证明,原核表达质粒GST-hCAP构建成功,用Western blot方法也证实了GST-hCAP融合蛋白的表达。结论:成功地构建了GST-hCAP原核表达载体,证实了其在原核细胞大肠埃希菌中的表达,为进一步纯化CAP及研究其结构与功能提供了前提基础。

不同固定液对胃癌细胞骨架及连接蛋白荧光染色标记效果的比较

目的通过激光共聚焦技术,观察SGC-7901胃癌细胞系在不同固定液作用下的细胞骨架及连接蛋白荧光染色。方法接种SGC-7901细胞24 h后,分别用4%多聚甲醛、2.5%戊二醛及95%乙醇室温固定20 min,5%BSA(含0.2%Triton X-100)封闭透膜1 h,直标荧光一抗避光37℃孵育1 h,DAPI室温染核15 min,激光共聚焦扫描显微镜扫描。结果 4%多聚甲醛对细胞骨架微丝结构及连接蛋白Zo-1细胞膜定位均有较好的固定作用,2.5%戊二醛对微丝结构基本起到固定作用,而95%乙醇对于微丝的固定效果略差。后两种固定液固定细胞均出现连接蛋白胞质表达的非特异染色现象。结论 4%多聚甲醛对细胞骨架及细胞间连接蛋白的固定效果较优,荧光染色标记结果为后续研究提供依据。

西咪替丁增强5-氟脲嘧啶对人胃癌细胞的生长抑制作用

目的观察不同浓度的西咪替丁、5-氟脲嘧啶(5-Fu)单用或联合应用对人胃癌细胞MGC-803、BGC-823生长及凋亡的影响。方法用MTT法检测西咪替丁与5-Fu联合应用对胃癌细胞MGC-803、BGC-823存活率的影响;流式细胞仪检测西咪替丁与5-Fu联合应用对胃癌细胞凋亡率的影响。结果西咪替丁与5-Fu联合应用时,西咪替丁在无毒浓度(5～50μmol/L)即可显著增强低浓度5-Fu对胃癌细胞的生长抑制作用。同时还发现,西咪替丁能增强5-Fu诱导胃癌细胞凋亡。结论西咪替丁可提高人胃癌细胞MGC-803、BGC-823对化疗药物5-Fu的敏感性,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。

3*Flag-hPAK4重组质粒的构建及其在COS7细胞中的表达与定位

目的:构建3*Flag-hPAK4真核表达质粒,证实融合蛋白在细胞内的表达与定位,并纯化PAK4蛋白。方法:提取人乳腺癌细胞MCF-7 mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增hPAK4全长编码基因,亚克隆至含有3*Flag标签的真核表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到非洲绿猴肾成纤维细胞COS7中,提取细胞蛋白进行Western blotting检测,同时利用共聚焦激光扫描显微镜观察3*Flag-hPAK4在COS7细胞内定位。使用免疫沉淀的方法纯化PAK4蛋白。结果:hPAK4全长基因序列克隆到了真核表达载体3*Flag中,酶切鉴定片段为1 800 bp。Western blotting检测到了融合蛋白3*Flag-hPAK4的表达,分子质量约为68 kDa,3*Flag-hPAK4在COS7细胞中表达定位在细胞浆中,成功纯化了PAK4蛋白。结论:成功地构建了3*Flag-hPAK4真核表达质粒,同时鉴定了3*Flag-hPAK4融合蛋白的表达,并纯化了PAK4蛋白。3*Flag-hPAK4蛋白主要定位在细胞浆中。

骨肉瘤细胞中Sestrin2的表达和定位

目的:构建新型人源真核表达载体3*Flag-h Sesn2并同时检测其在骨肉瘤细胞中的表达及定位。方法:以GST-h Sesn2作为模板,利用聚合酶链反应扩增目的基因h Sesn2的c DNA全长,并将其克隆到含有3*Flag标签的真核表达载体中。进一步将构建的重组质粒酶切并测序分析鉴定,转染至MG-63骨肉瘤细胞中,提取细胞总蛋白后进行Western blot检测重组蛋白表达。此外利用荧光共聚焦激光扫描显微镜检测3*Flag-h Sesn2在MG-63细胞系中的定位,并最终利用免疫沉淀方法纯化人源Sesn2蛋白。结果:h Sesn2基因c DNA全长成功构建于含有3*Flag标签的真核表达载体中,利用Western blot检测3*Flag-h Sesn2融合蛋白表达,分子量约为55k Da。3*Flag-h Sesn2在MG-63骨肉瘤细胞系中主要定位于细胞质及核周,进一步成功纯化了h Sesn2蛋白。结论:成功的构建了含有3*Flag标签的人源Sesn2真核表达质粒,同时鉴定3*Flag-h Sesn2融合蛋白的表达,最终成功纯化h Sesn2蛋白。其中3*Flag-h Sesn2蛋白主要定位在细胞质和核周。

p57^(kip2)蛋白在乳腺癌组织和细胞系中的表达和定位

目的:研究p57kip2在人乳腺癌组织和细胞系中的表达和定位。方法:免疫印迹法检测人乳腺肿瘤细胞系中p57kip2的表达。人乳腺肿瘤组织进行免疫组化染色,检测p57kip2在组织中的表达。激光共聚焦扫描显微镜检测内源p57kip2在MCF-7细胞中的定位。结果:p57kip2在乳腺癌细胞系内表达,免疫组化染色分析和激光共聚焦扫描显微镜证实p57kip2主要定位于细胞核内。结论:p57kip2在乳腺癌细胞内表达,p57kip2主要定位于乳腺癌组织细胞核内,可能是参与肿瘤细胞基因转录调控和蛋白表达的重要蛋白之一。

人Elf5基因真核表达质粒的构建及其亚细胞定位

目的:构建人Elf5真核细胞表达质粒,并研究其在乳腺癌MCF7细胞中的亚细胞定位。方法:PCR扩增人Elf5基因,将其克隆入真核表达载体pEGFP-C1中,构建含人Elf5基因的真核表达质粒pEGFPhElf5。利用酶切鉴定,DNA测序,免疫印迹及免疫荧光方法鉴定Elf5真核表达质粒及Elf5蛋白的亚细胞定位。结果:经酶切鉴定、DNA测序、免疫印迹方法确认Elf5基因成功导入真核表达载体pEGFP-C1。瞬时转染MCF7细胞,Elf5蛋白表达在细胞核中。结论:pEGFP-Elf5真核表达质粒构建成功,Elf5定位在细胞核中。

骨肉瘤MG-63细胞中Polo样激酶2的表达和定位

目的:构建真核表达载体*3 Flag-hPlk2并检测其在骨肉瘤细胞内的表达及定位。方法:以GST-hPlk2为模板,利用PCR扩增hPlk2基因cDNA全长,并将其克隆至含有*3 Flag标签的真核表达载体中。将构建的重组质粒进行酶切和测序鉴定,并转染到骨肉瘤细胞MG-63中,提取细胞蛋白进行Western blot检测。利用共聚焦激光扫描显微镜观察*3 Flag-hPlk2在MG-63细胞中的定位,免疫沉淀法纯化hPlk2蛋白。结果:hPlk2基因cDNA全长成功构建到真核表达载体*3 Flag中,Western blot检测到*3 Flag-hPlk2融合蛋白表达,分子量约为80kDa。*3 Flag-hPlk2在骨肉瘤MG-63细胞中主要定位于细胞质和核周,并成功纯化hPlk2蛋白。结论:成功构建了*3 Flag-hPlk2真核表达质粒,同时鉴定了*3 Flag-hPlk2融合蛋白的表达,并纯化hPlk2蛋白。*3 Flag-hPlk2蛋白主要定位在细胞质和核周。

γ-干扰素诱导大肠癌CCL229细胞表达LEA抗原的电镜研究

目的 :探讨 γ-干扰素对人大肠癌细胞系肿瘤相关抗原 L EA表达的诱导作用。方法 :将 γ-干扰素与人大肠癌 CCL 2 2 9细胞共育培养 ,通过免疫铁蛋白电镜观察γ-干扰素对人大肠癌细胞系 CCL 2 2 9诱导作用的超微结构变化。结果 :电镜观察发现 ,γ-干扰素诱导后 ,CCL 2 2 9细胞表面皱褶增多 ,形成大量不规则突起 ,并且 CCL 2 2 9细胞针状伪足萎缩 ,微绒毛大多呈球状分布于胞体四周。结论 :电镜超微结构的变化与 γ-干扰素诱导后 L EA抗原表达量增加有关 ,并且 γ-干扰素可能有抑制肿瘤细胞游走性、降低肿瘤细胞转移性的作用。

大肠癌细胞凋亡模型的建立及凋亡细胞内质网膜系统的变化

目的 :建立全反式维甲酸 (ATRA)诱导人大肠癌细胞凋亡的体外模型 ,观察凋亡细胞内质网膜系统的变化。方法 :应用光镜、透射及扫描电镜、DNA凝胶电泳、流式细胞术及末端脱氧核苷酰转移酶原位标记 (TU NEL法 ) ,观察维甲酸诱导的人大肠癌 CCL2 2 9细胞凋亡特征。结果 :维甲酸诱导 CCL2 2 9细胞凋亡 ,产生典型的形态学改变 ,在琼脂糖凝胶电泳上呈现特征性的 DNA ladder,DNA直方图上显示亚二倍体峰 ,具有时间和剂量依赖性。CCL2 2 9细胞在被维甲酸诱导成熟分化后发生凋亡。凋亡过程中内质网膜系统的结构与分布变化为 :内质网逐渐减少 ,向核周聚集 ,部分呈扩张状态 ,形成大小不等的小泡状或短管状结构。结论

bFGF促进人大肠癌LoVo细胞增殖的信号转导机制

目的:通过改变碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)作用于LoVo细胞的时间,检测PKB活性和CyclinA的表达情况,进一步研究bFGF通过PI3-K/PKB通路调控大肠癌细胞生长的信号转导机制.方法:MTT法分析bFGF对LoVo细胞增殖程度的影响;(γ-32P)ATP掺入法检测大肠癌LoVo细胞株中PKB的活性;RT-PCR法检测大肠癌LoVo细胞株中CyclinA的表达;Westernblot法检测bFGF作用LoVo细胞后CyclinA的表达.结果:bFGF以不同时间作用于LoVo细胞时,通过(γ-32P)ATP掺入法检测发现其可提高细胞PKB活性,PI3-K的抑制剂LY294002预处理后再施加bFGF,可显著降低PKB的活性,两者相比差异显著[704.32±12.35pmol/(mg·min)vs1352.79±19.85pmol/(mg·min),P<0.05].bFGF刺激LoVo细胞时CyclinA蛋白和CyclinAmRNA表达均高于其他各施加因素组,而PI3-K的抑制剂LY294002组的CyclinA蛋白和CyclinAmRNA明显降低.结论:bFGF刺激大肠LoVo细胞后可通过依赖PI3-K/PKB途径调节CyclinA的转录活性,促进其表达,进而促进细胞增殖.