胃癌细胞中p21活化激酶4的表达和定位

目的构建真核表达载体pEGFP-PAK4,利用它鉴定p21活化激酶4(PAK4)在胃癌细胞中的定位,并检测外源性和内源性PAK4在胃癌细胞中的表达。方法以pCAN2-MYC-PAK4为模板,采用PCR法进行人PAK4编码序列的扩增,并将其克隆至真核表达载体pEGFP-C1中。将pCAN2-MYC-PAK4质粒瞬时转染到胃癌BGC-823细胞中,用Western blot方法检测MYC-PAK4融合蛋白的表达;并用Western blot方法检测不同胃癌细胞系中内源性PAK4的表达;瞬时转染pEGFP-PAK4到胃癌BGC-823细胞中,用激光扫描共聚焦显微镜观察PAK4的定位。结果(1)hPAK4编码序列被成功克隆至真核表达载体pEGFP-C1中;(2)证实了MYC-PAK4融合蛋白及内源性PAK4在胃癌细胞中的表达;(3)转染pEGFP-PAK4后,在胃癌BGC-823细胞胞质内可见明亮的绿色荧光。结论成功地构建了pEGFP-PAK4载体,证实了外源性和内源性PAK4的表达,证明在胃癌BGC-823细胞中PAK4主要定位于细胞质,为进一步研究PAK4的生物学特性及其信号转导通路奠定了基础。

人pEGFP-PKARIIβ重组质粒的构建及其在BGC-823胃癌细胞中的表达

目的:研究人的蛋白激酶A调节亚基RIIβ(PKARIIβ)基因的绿色荧光蛋白(GFP)真核表达载体融合蛋白在胃癌细胞BGC-823内的表达和定位,初步探讨其在肿瘤细胞中的分子作用机制.方法:以pRSETB-PKARIIβ质粒为模板,PCR扩增出全长PKARIIβ编码序列,用XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切后,亚克隆至含有GFP标签的融合表达载体pEGFP-C1中.测序正确后,将重组质粒转染到胃癌细胞BGC-823中,提取细胞蛋白进行Westernbolt检测.利用共聚焦激光扫描显微镜观察pEGFP-PKARIIβ在人胃癌细胞BGC-823内的定位.结果:将人全长PKARIIβ编码序列克隆到了真核表达载体pEGFP-C1中,酶切鉴定片段为1.2kb,在预期的位置产生条带.Western blot检测到了融合蛋白正确表达,分子量约为72000Da.并观察到GFP-PKARIIβ在HEK293和BGC-823细胞内都有表达,且定位以细胞质为主,在细胞核内少量表达.结论:成功构建了人全长PKARIIβ编码序列的pEGFP-PKARIIβ真核表达载体,证实GFP-PKARIIβ蛋白在BGC-823细胞质内特异表达,为进一步研究PKARIIβ的在胃癌中的功能提供了重要的实验材料.

DIXDC1的生物学特性及其与肿瘤的关系

DIXDC1是一种含有Dishevelled-Axin(DIX)和coiled-coil(MTH)两种结构域的蛋白,也是Wnt信号通路的正向调节分子,在细胞周期、神经系统发育和行为认知等方面均发挥着重要作用。DIXDC1在多种肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用,能够激活PI3K/AKT信号通路,促进结肠癌细胞的增殖;激活PI3K-AKT/AP-1信号通路,促进肺癌组织细胞的侵袭和迁移;激活Wnt信号通路,调节β-catenin入核,进而促进胃癌细胞的侵袭和迁移。由于DIXDC1在肿瘤中产生的巨大作用,为肿瘤治疗提供了一个潜在靶点。

抗人大肠癌双价单链抗体基因的构建及表达

目的:构建抗人大肠癌重组双价单链抗体ND- 1sc(Fv)2的融合基因,并在大肠杆菌中表达．方法:采用基因重组技术借助GGGGS Linker序列,将2个相同的ND-1scFv基因共价连接,构建pET-28a(+)ND-1sc(Fv)2表达载体,并在大肠杆菌中表达双价单链抗体的融合蛋白．表达产物用Ni-NTA resin亲和层析方法纯化,SDS- PAGE和Western blotting检测表达的目的蛋白．间接免疫荧光和ELISA检测抗体的免疫活性．结果:序列测定表明:ND-1sc(Fv)2基因全长1473 bp,包含了2个729 bp的scFv序列和15 bp的GGGGS序列．SDS-PAGE和Western blotting检测显示,融合蛋白的Mr55 000,与预期值一致．ND-1sc(Fv)2表达产物以不溶性包涵体形式存在,经亲和层析纯化后蛋白纯度达90％,间接免疫荧光及ELISA检测表明,ND-1sc(Fv)2保留了亲本抗体的免疫活性,对表达有相应抗原的靶细胞具有特异结合活性,其免疫活性明显高于ND-1scFv．结论:成功地构建了抗人大肠癌双价单链抗体ND-1sc(Fv)2,并在大肠杆菌中高效表达．融合蛋白具有良好的免疫活性．

GST／RIPX融合蛋白表达载体的构建及其在大肠埃希菌中的表达

目的构建GST/RIPX融合蛋白基因表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达。方法以质粒pcDNA3.1-RIPX为模板,通过BamH1和Xho1酶切位点将RIPX定向插入pGEX-4T-2中,构建原核表达质粒pGEX-4T-2-RIPX,并转化E.coli DH5α,筛选阳性重组子,限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列测定正确后,转入化E.coli BL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达,鉴定。结果酶切及测序结果证明,成功构建了原核表达质粒pGEX-4T-2-RIPX,并用SDS-PAGE方法证实了GST/RIPX融合蛋白的表达。结论成功构建了RIPX原核表达载体,并证实了融合蛋白的表达,为进一步纯化RIPX蛋白和研究RIPX的生物学功能奠定了基础。

人源MAP3K7克隆及其GST融合蛋白的表达和鉴定

目的构建MAP3K7蛋白GST的融合表达载体,高效表达和纯化GST-MAP3K7融合蛋白,为GST Pulldown实验做准备。方法通过PCR扩增MAP3K7全长编码基因,经双酶切定向克隆至表达载体pGEX-5X-1,构建原核重组表达载体pGEX-5X-1-MAP3K7,通过酶切和测序鉴定后,导入E.coli BL21宿主菌中,IPTG诱导表达融合蛋白,经谷胱甘肽琼脂糖凝胶纯化表达产物,SDS-PAGE和Western blot分析鉴定。结果经测序鉴定成功构建了原核重组表达载体pGEX-5X-1-MAP3K7,诱导后的GST融合蛋白经SDS-PAGE和Western blot检测到分子量正确的特异性蛋白条带,经纯化后,得到了高纯度的融合蛋白。结论成功构建了MAP3K7全长的GST重组表达载体,确定了GST-MAP3K7融合蛋白表达的最佳条件,诱导成功并得到了高纯度的融合蛋白,为进一步研究MAP3K7蛋白的生物学功能奠定了基础。

hLMO1编码基因重组质粒的构建及蛋白的表达和定位

目的构建hLMO1真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位。方法以人胎脑文库cDNA为模板,PCR扩增hLMO1基因cDNA全长,亚克隆至pEGFP表达载体中。将构建的重组质粒进行酶切测序鉴定,并转染到人上皮细胞——HEK293细胞中,提取细胞蛋白进行Western blot检测。利用激光扫描共聚焦显微镜观察pEGFP-hLMO1在HEK293细胞内的定位。结果hLMO1基因cDNA全长克隆到了真核表达载体pEGFP中,酶切鉴定片段为471bp。Western blot检测到了融合蛋白表达,分子量约为45kDa。pEGFR-LMO1在人HEK293细胞核与细胞质均有表达。结论成功构建了hLMO1基因cDNA全长的真核表达载体,pEGFP-LMO1蛋白定位于HEK293细胞的细胞质和细胞核内。

应用微流控芯片富集循环肿瘤细胞的发展现状及展望

循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,CTCs)存在于肿瘤患者的外周血中,与恶性肿瘤的转移、预后评价以及临床的个体化治疗均密切相关。相比于组织活检,CTCs的检测仅需抽取静脉血即可进行,因而具有取样简单、可重复性、无创等优点。CTCs的富集方法有很多,近年来兴起的微流控芯片分选技术具有高通量、低消耗、可集成等特点。基于CTCs的物理性质和生物性质所设计的不同芯片在分选速度、效率、纯度以及细胞活性保持方面各有优势,本文将对此加以重点阐述。

胃癌SGC-7901细胞中人RIPX—GFP融合蛋白载体构建及表达定位

目的构建真核表达载体pEGFP—RIPX，并鉴定RIPX在胃癌细胞中的定位，并检测外源性RIPX的表达。方法以pBluescriptR—RIPX为模板，采用PCR法进行人RIPX编码序列（CDS）的扩增，并将其克隆至真核表达载体pEGFP—C1中。将pEGFP—RIPX质粒瞬时转染到胃癌SGC-7901细胞中，用Western印迹方法检测GFP—RIPX融合蛋白的表达；用激光扫描共聚焦显微镜观察RIPX的定位。结果人的RIPX编码序列被成功克隆至真核表达载体pEGFP—C1中；证实了GFP—RIPX融合蛋白的表达；转染pEGFP．RIPX后，在胃癌SGC-7901细胞胞质内可见明亮的绿色荧光。结论成功地构建了pEGFP-RIPX载体，鉴定了外源性RIPX的表达；同时证实在胃癌SGC-7901细胞中RIPX主要定位于细胞质，为进一步研究RIPX的生物学特性及其信号转导通路奠定了基础。

C／EBPα不同截短功能域GST融合蛋白表达载体的构建及表达的研究

目的构建GST-C/EBPα融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达。方法以质粒pcDNA3.1-C/EBPα为模板,用PCR法扩增C/EBPα全长及各个截短片段,通过EcoRI和XhoI酶切位点将C/EBPα全长及各个截短突变体定向插入pGEX-5X-1中,构建原核表达质粒pGEX-5X-1-C/EBPα及其截短突变体,并转化E.coli DH5α,筛选阳性重组子,限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列测定正确后,转入E.coli BL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达,SDS-PAGE和SDS-PAGE鉴定。结果酶切及测序结果证明,成功构建了原核表达质粒pGEX-5X-1-C/EBPα及其截短突变体,并用SDS-PAGE方法证实了GST-C/EBPα全长及各个截短突变体融合蛋白的表达。结论成功构建了C/EBPα原核表达载体及其截短突变体,并证实了融合蛋白的表达,为进一步纯化C/EBPα蛋白和研究C/EBPα的生物学功能奠定了基础。

人大肠癌抗原基因cDNA噬菌体表达文库的构建和鉴定

目的:为获得大肠癌的特异性抗原基因,构建人大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体表达文库。方法:从2株人大肠癌细胞CCL-187和CX-1中提取总RNA,分离纯化mRNA,并以此为模板合成第1链cDNA,用置换法合成第2链cD-NA。双链cDNA经末端削平、EcoRⅠ接头连接、XhoⅠ酶切、过柱分级分离,除去<400bp片段。收集符合需要的cDNA片段与噬菌体ZAPExpress载体连接,体外包装后获得人大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体表达文库。结果:构建的人大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体文库,原始库容量为2.3×109pfu/L,重组率97%。重组子插入cDNA片段平均大小1kb以上。结论:成功地构建高质量的人大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体表达文库,为大肠癌的特异性抗原筛选奠定了基础。

GST/HIF-1α融合蛋白表达载体的构建及其在大肠埃希菌中的表达

目的构建GST/HIF-1α融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达。方法以质粒pcDNA3.1-HIF-1α为模板,用PCR法扩增HIF-1α全长及各个截短片段,通过BamHI和NotI酶切位点将HIF-1α全长及各个截短突变体定向插入pGEX-4T-2中,构建原核表达质粒pGEX-4T-2-HIF-1α及其截短突变体,并转化E.coli DH5α,筛选阳性重组子,限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列测定正确后,转入E.coli BL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果酶切及测序结果证明,成功构建了原核表达质粒pGEX-4T-2-HIF-1α及其截短突变体,并用Western blot方法证实了GST/HIF-1α全长及各个截短突变体融合蛋白的表达。结论成功构建了HIF-1α原核表达载体及其截短突变体,并证实了融合蛋白的表达,为进一步纯化HIF-1α蛋白和研究HIF-1α的生物学功能奠定了基础。

组蛋白脱乙酰化酶GST-HDAC1融合蛋白载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的构建GST-HDAC1融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达。方法以质粒pcDNA3.1-HDAC1为模板进行PCR,通过EcoR1单酶切位点将HDAC1插入pGEX-5X-1中,构建原核表达质粒pGEX-5X-1-HDAC1,并转化E.coli DH5α,通过利用载体上的BamH1酶切位点和HDAC1上Nde1酶切位点来筛选阳性重组子,DNA序列测定正确后,转入化E.coli BL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达,鉴定。结果酶切后获得940bp片段为正向;如获得500bp片段为反向。重组质粒测序后与GenBank进行同源性比对证明导入片段为HDAC1,成功构建了原核表达质粒pGEX-5X-1-HDAC1,并用SDS-PAGE方法证实了GST-HDAC1融合蛋白在大肠杆菌中的表达。结论成功构建了HDAC1原核表达载体,并证实了融合蛋白在大肠埃希菌中的表达,为进一步纯化HDAC1蛋白及与其它蛋白的关系奠定了基础。

壳聚糖多孔明胶微球温敏凝胶载药体的建立与评价

目的 寻找有效的跨圆窗膜载药体,制备多孔明胶微球结合壳聚糖/β-GP溶液的温敏特点,制备新型可注射、可降解、无毒副作用并具有缓释效应的药物载体,为后续动物实验提供研究基础。方法 利用化学反应合成碳酸钙（CaCO_3）模板,采用W/O型乳化-固化法制备了明胶-碳酸钙复合微球,用EDTA处理除去碳酸钙,得到多孔的明胶微球。并以环境扫描电子显微镜对多孔明胶微球进行表征。利用壳聚糖与β-GP合成溶液物理混合形成壳聚糖多孔明胶微球温敏凝胶载药体。结果 扫描电镜显示,明胶微球表面呈多孔结构,粒径在2~4um之间。壳聚糖/β-GP冻干后呈多孔网络状。壳聚糖/β-GP具有温敏性,且两者共混后温敏性不变。结论 壳聚糖/β-GP溶液共混可制备成具有温敏效果的凝胶载药体,为跨膜药物转运的研究提供基础。

原核表达载体GST-RUNX3的构建及其在大肠杆菌表达

目的构建GST/RUNX3融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达。方法利用Kpn1和Xho1位点酶切pcDNA3.1-RUNX3质粒,将获得的1300bpRUNX3编码序列插入到pGEX-4T-2中,构建pGEX-4T-2-RUNX3质粒,并转化E.coli DH5α,筛选阳性重组子,酶切鉴定和DNA序列测定正确后,转入BL21中,经IPTG诱导表达后SDS-PAGE电泳鉴定。结果酶切pGEX-4T-2-RUNX3质粒获得1300bpRUNX3片段,经测序后获得的DNA序列与GenBank进行同源性比对,证实pGEX-4T-2-RUNX3构建成功。在E.coli BL21用IPTG进行诱导表达后,SDS-PAGE电泳方法证实了GST-RUNX3融合蛋白表达。结论成功构建了RUNX3原核表达载体,其融合蛋白在大肠埃希菌表达,为进一步纯化RUNX3蛋白和研究RUNX3的生物学功能奠定了基础。

Chip-based TGCE定量检测大肠癌K-ras基因点突变

目的建立一种定量检测大肠癌中K-ras基因突变比例的方法,并分析其与临床病理参数之间的关系。方法利用微流控温度梯度毛细管电泳(Chip-based temperature gradient electrophoresis,Chip-basedTGCE)对4例代表性大肠癌组织切片中的K-ras基因突变进行检测,通过AutoCAD软件计算出K-ras基因突变比例,结果经克隆测序校正后获得线性回归方程。应用该方法定量检测84例石蜡包埋大肠癌组织中的K-ras基因突变比例,并探讨其与临床病理参数的关系。结果 Chip-based TGCE检测K-ras基因突变比例与克隆测序检测K-ras突变比例的线性回归方程为y=0.993x-1.387,K-ras基因突变比例与肿瘤部位和浸润深度有显著相关性(P<0.05),检测获得的最低K-ras突变比例达到2.51%。结论该研究显示Chip-based TGCE是一种快速、灵敏、便捷、经济的基因突变比例定量分析方法。

原核表达载体GST-RUNX3的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的构建GST/RUNX3融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达。方法以质粒pcDNA3.1-RUNX3为模板,通过Kpn1和Xho1酶切位点将RUNX3定向插入pGEX-4T-2中,构建原核表达质粒pGEX-4T-2-RUNX3,并转化E.coliDH5α,筛选阳性重组子,限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列测定正确后,转入E.coliBL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达,鉴定。结果双酶切获得1300bp片段,证明RUNX3片段被成功导入pGEX-4T-2,并在测序后与GenBank进行同源性比对,比对进一步证实原核表达质粒pGEX-4T-2-RUNX3构建成功,并用IPTG诱导,SDS-PAGE方法证实了GST/RUNX3融合蛋白在大肠杆菌中的表达。结论成功构建了RUNX3原核表达载体,并证实了融合蛋白在大肠埃希菌中的表达,为进一步纯化RUNX3蛋白和研究RUNX3的生物学功能奠定了基础。

CUEDC2介导肿瘤发生相关机制的研究进展

CUEDC2是一种普遍存在于许多肿瘤中的蛋白质,与肿瘤的发生以及预后治疗存在着紧密关系,近年来越来越受到广泛的关注和重视。现从CUEDC2在乳腺癌中的作用,对有丝分裂细胞周期、炎症反应的信号通路和巨噬细胞的调节,以及CUEDC2与一些新兴领域如褪黑素以及热休克蛋白的关系入手,对CUEDC2介导肿瘤发生相关机制的研究进展进行综述。