JCV病毒T抗原诱发晶状体上皮肿瘤动物模型建立

目的利用α-crystallin启动子构建晶状体上皮细胞中JCV T抗原表达转基因鼠,试图建立晶状体自发肿瘤动物模型。方法利用限制性内切酶BclI分离pBSK(pBluescript SK)-T抗原,BamH I同尾连接插入以pBSK为载体的α-crystallin启动子下游,通过NciI酶切电泳分离带有α-crystallin启动子的T抗原核酸序列后显微注射入C57BL/6J小鼠受精卵中。PCR检测转基因阳性鼠及JCV病毒T抗原拷贝数,大体和组织学观察眼球及病变组织,免疫组织化学观察T抗原、p53和β-catenin表达。结果成功构建α-crystallin JCV T抗原表达质粒,转基因阳性鼠中2号鼠(αAT-2)拷贝数最高,该鼠眼球于11个月表现出肿瘤样改变,肿瘤细胞中T抗原、p53和β-catenin呈强阳性表达。结论 JCV T抗原直接诱发晶状体上皮肿瘤动物模型建立为JCV T抗原嵌入所致上皮肿瘤提供了直接实验依据,为JCV所致上皮肿瘤发生和演进分子机理研究奠定坚实基础,同时为抗肿瘤药物筛选及基因治疗监控提供了良好的动物模型。

突变DJ-1转基因小鼠模型的建立

目的探讨DJ-1L166P突变基因在帕金森病发生中的作用。方法构建pcDNA3.1-myc-his-DJ-1L166P真核表达载体,利用显微注射方法将DJ-1L166P基因片段(约3.9kb)导入BDF1小鼠受精卵雄原核并移植到同期受孕的ICR假孕母鼠输卵管中,对产出仔鼠的鼠尾组织DNA进行聚合酶链反应和Southern blot检测,对Southern blot鉴定阳性的转基因小鼠进行逆转录聚合酶链反应和Western blot检测。结果共产生20只子代小鼠,1号和7号为DJ-1L166P转基因阳性小鼠。1号转基因小鼠大脑、小脑、肝、肺、肾、睾丸有不同程度的DJ-1mRNA表达,均高于正常对照小鼠,但只有大脑中DJ-1mRNA的表达水平显著高于正常对照小鼠(P<0.05);7号转基因小鼠只有肝、肺组织中有DJ-1mRNA表达,也高于正常对照小鼠,但差异无统计学意义。只有1号小鼠大脑有His标签蛋白的表达。结论成功获得1只DJ-1L166P基因突变转基因小鼠模型,为课题的下一步实验研究打下良好的基础。

晶状体自发肿瘤转基因鼠脑横截面标本制备及鉴定

目的确定JCV T抗原诱发晶状体肿瘤转基因鼠脑中肿瘤来源及路径。方法 18月龄转基因鼠麻醉后4%多聚甲醛灌流固定,EDTA脱钙颅骨软化后脑经横截制备石蜡标本并进行HE染色。免疫组化和免疫荧光确定脑组织T抗原表达。结果经过脱钙处理后颅骨组织非常软,横截后发现白色肿瘤组织蔓延至脑组织中,HE染色确定眼部和脑部白色组织均为晶状体肿瘤细胞,免疫组化和免疫荧光结果显示细胞核中存在T抗原强阳性表达。结论 JCV T抗原诱发晶状体肿瘤是经过视神经孔进入脑组织,鼠头横截面组织标本制备对研究头部肿瘤的毗邻关系和肿瘤组织在脑组织中侵袭部位极具应用价值。

急性白血病患者P-糖蛋白的表达及功能分析

目的:研究P-糖蛋白(P-gp)在急性白血病(AL)患者中的表达及功能。方法:用免疫组化检测CD34、P-gp的表达,用流式细胞术检测P-gp的表达、功能。结果:CD34表达与P-gp表达、功能呈正相关(P=0.001,r=0.475;P=0.003,r=0.429),P-gp表达与功能呈正相关(P=0.031,r=0.341)。初治急性早幼粒细胞白血病(APL)组中无P-gp表达+、P-gp功能+,明显低于初治急性髓细胞白血病(AML)组(41.1%,35.3%,P<0.05)。初治急性淋巴细胞白血病(ALL)组中P-gp表达+28.6%,P-gp功能+28.6%,与初治AML组无差异(P>0.05)。初治AL组P-gp表达+25%,复发/难治组中P-gp表达+33.3%,两组无差异(P>0.05);P-gp功能+22.7%,低于复发/难治组P-gp功能+66.7%(P<0.05)。<50岁初治AL组P-gp表达+26.3%,与≥50岁初治AL组无差异(P>0.05);P-gp功能+15.8%,低于≥50岁初治AL组(P<0.05)。结论:P-gp功能的检测对AL的化疗更有临床指导意义。

黄芪注射液对D-半乳糖所致衰老小鼠的免疫、衰老和血脂指标的影响

目的探讨黄芪注射液对D-半乳糖致衰老小鼠抗衰老作用。方法皮下注射D-氨基半乳糖制作衰老鼠模型,同时每日对不同组小鼠分别腹腔给予相应药物,8周后处死小鼠,观测小鼠血液中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG),并测定肝脏、脾脏与胸腺的系数。结果与模型组相比,模型+黄芪组血清中SOD明显升高,MDA、TC和TG含量降低。结论黄芪注射液能提高机体抗氧化酶活性,增加免疫器官质量,有较好的抗衰老作用。

RNA干扰下调Slug表达对肺癌细胞A549的细胞周期、增殖和侵袭的影响

目的:应用RNA干扰技术下调肺癌A549细胞中Slug基因的表达,探讨其对A549细胞增殖、细胞周期和细胞侵袭能力的影响。方法:构建靶向Slug基因的shRNA真核表达质粒pGPU6-GFP-Neo-Slug,与阴性对照质粒pNeg-shRNA分别用脂质体法转染A549细胞。Real-time PCR和Western blotting验证转染后Slug mRNA和蛋白的表达。CCK-8法、流式细胞术和Transwell实验分别检测下调Slug表达对A549细胞增殖、细胞周期和侵袭能力的影响。结果:成功构建pGPU6-GFP-NeoSlug载体并转染A549细胞,转染率达90%。与pNeg-shRNA组和空白对照组相比,pSlug-shRNA组A549细胞中Slug mRNA[(0.23±0.01)vs(0.97±0.08)、(1.0±0.09),P<0.05]和蛋白[(0.20±0.09)vs(1.0±0.32)、(1.13±0.26),P<0.05]表达量显著降低;细胞增殖抑制率明显上升[(35.3±5.4)%vs(1.5±0.2)%、(3.3±0.7)%,均P<0.01];细胞增殖指数显著降低[(32.92±0.69)%vs(48.19±0.71)%、(42.88±0.75)%,均P<0.05],并且处于G1期细胞数明显增多[(67.08±0.92)%vs(52.81±0.78)%、(56.12±0.73)%,均P<0.05];细胞侵袭能力显著降低[穿透基底膜细胞数:(55±9)vs(169±12)、(173±15),均P<0.01]。结论:pGPU6-GFP-Neo-Slug转染肺癌A549细胞能有效下调Slug基因的表达,从而抑制A549的增殖侵袭能力、阻滞细胞周期于G1期。

配套工程在屏障环境设施建设中的重要性

结合中国医科大学实验动物部屏障系统配套设施建设的实际,从技术指标监控和设施建设的合理性两方面进行探讨,分析屏障系统配套设施在建设及建后使用维护过程中面临的问题。探讨节能、环保理念应用于屏障环境设施建设中的可行性等问题。

RPS12基因表达与胃癌进展及淋巴结转移的研究

目的探讨核糖体蛋白S12(RPS12)基因表达与胃癌进展及淋巴结转移的关系。方法采用原位杂交方法检测39例进展期胃癌组织、17例正常胃黏膜中RPS12mRNA表达。结果胃癌中RPS12mRNA表达阳性表达率(87.2%)显著高于正常胃黏膜(17.6%),P<0.01;淋巴结转移阳性的胃癌中RPS12mRNA表达阳性率(96.2%)显著高于淋巴结转移阴性者(69.2%),P<0.05。结论RPS12基因高表达与胃癌进展及淋巴结转移有关。

七氟醚预处理对体外循环诱发大鼠脑损伤的影响

目的评价七氟醚预处理对体外循环（CPB）诱发大鼠脑损伤的影响。方法SD雄性大鼠40只，6—8月龄，体重350—450g，采用随机数字表法分为5组（n=8）：假手术组（S组）、CPB组和不同浓度七氟醚预处理组（SP1组、SP2组和SP3组）。SP1组、SP2组和SP3组吸入七氟醚1h进行预处理，呼气末浓度分别为1．2％、2．4％和3．6％，然后建立CPB。分别于七氟醚预处理后转流前（T0）、CPB30min（T1）、CPB停止即刻（T2）和CPB后1、2、3h（T3-5）时，取颈静脉血样，采用ELISA法测定血清S-10013蛋白浓度。于T5时处死大鼠，取海马组织，采用TUNEL法检测神经元凋亡情况，采用免疫组织化学法检测NF—KBp65表达水平。结果与S组比较，CPB组、SP1组、SP2组和SP3组T1-5时血清S-100β蛋白浓度升高，海马凋亡神经元增多，NF—κBp65表达上调（P〈0．05）；与CPB组比较，SP1组、SP2组和SP3组T1-5时血清S-100β蛋白浓度降低，海马凋亡神经元减少，NF—κBp65表达下调（P〈0．05）；与SP1组比较，SP2和SP3组T1-5时血清S-10013蛋白浓度降低，海马凋亡神经元减少，NF—κBp65表达下调（P〈0．05）；与SP2组比较，SP3组T1-5时血清S-10013蛋白浓度降低，海马凋亡神经元减少，NF—κBp65表达下调（P〈0．05）。结论七氟醚预处理可减轻CPB诱发大鼠脑损伤，其机制可能与抑制海马神经元NF—κB的活性有关。