应用Dicer1转基因小鼠建立黑色素瘤模型的研究

目的应用D妇r1（编码蛋白属于RNA酶Ⅲ家族）转基因小鼠建立黑色素瘤模型。方法将小鼠黑色素瘤细胞株分别移植于Dicer1转基因鼠和C57BL／6J小鼠前肢腋下，观察两种小鼠的荷瘤情况，包括移植瘤生长情况、移植瘤生长曲线。结果与C57BL／6J小鼠组肿瘤比较，Dicer1转基因小鼠组的肿瘤成瘤时间短、肿瘤生长速度快、肿瘤体A（P〈0．05）。结论应用Dicer1转基因小鼠建立了黑色素瘤模型，结果显示Dicer1基因对黑色素瘤荷瘤有明显影响。

体外受精-胚胎移植技术在APP/PS1双转基因小鼠繁育中的应用

目的 研究体外受精-胚胎移植（IVF-ET）技术在APP/PS1双转基因小鼠繁育中的应用.方法 分别应用自然交配与体外受精方法进行APP/PSl双转基因繁育,比较受精率及产仔数量;腹腔注射PMSG-HCG超排雌性C57BL/6小鼠,分别与12周龄、24周龄、36周龄、52周龄、72周龄的成年雄性APP/PSl双转基因小鼠进行体外受精,将获得的2-细胞胚胎移植到假孕雌鼠的输卵管,通过PCR方法对仔代小鼠进行鉴定.结果 6只雄性转基因小鼠与18只野生型雌性小鼠自然方式交配,实验周期为21d,获得胚胎的受精率为73.3％.应用体外受精的方法用1只雄性转基因小鼠的精子与18只雌性野生型小鼠的胚胎进行体外受精,受精率达到95％,实验周期为4d.两种繁育方式产仔数量阳性生小鼠数量有显著差异（P＜0.05）,阳性生率无显著性差异（P＞0.05）. 12周龄、24周龄、36周龄的APP/PSl转基因雄性小鼠的体外受精结果显示,三种不同周龄的雄性APP/PS1转基因小鼠受精率、产仔数量及阳性率均无显著性差异（P＞0.05）.对应用常规繁育方法难以获得后代的老龄APP/PS1双转基因雄性小鼠（52周龄、72周龄）体外受精率分别为85.6％、84.1％,获得阳性后代18只和14只.结论 APP/PS1双转基因小鼠可以采用IVF-ET技术进行繁育,为APP/PS1双转基因小鼠快速扩大繁育提供一种新方式.

DJ-1^(L166P)与DJ-1^(M26I)基因对NIH3T3细胞增殖和凋亡的比较

目的在细胞学水平比较DJ、DJ-1M26 I、DJ-1L166 P基因对NIH 3T3细胞增殖速率与凋亡的关系,为建立转基因动物模型及帕金森疾病发病机制研究奠定基础。方法分别将pcDNA3.1/myc-His-DJ-1、pcDNA3.1/myc-His-DJ-1L166 P和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26 I重组质粒脂质体方法转染NIH 3T3细胞,500μg/ml G418压力筛选稳定克隆,对3种转染细胞在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平进行鉴定,采用MTT染色方法和Annexin V-FITC试剂盒进行转染阳性克隆细胞的细胞活力与细胞凋亡检测。结果 pcDNA3.1/myc-His-DJ-1、pcDNA3.1/myc-His-DJ-1L166 P和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26 I重组质粒转染NIH 3T3细胞经G418筛选后,PCR方法检测分别获得1个、4个、3个阳性细胞克隆,RT-PCR及Western blot方法进行DJ-1-His基因表达检测,结果均证明外源插入基因的表达,Caspase-3 RNA水平检测DJ-1L166 P和DJ-1M26 I组表达高于正常NIH 3T3细胞组,而DJ-1组caspase-3转录水平相对最低,MTT实验结果初步证明转染DJ-1L166 P和DJ-1M26 I基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率均低于DJ-1组和正常NIH 3T3细胞组(P<0.05),转染DJ-1基因的NIH 3T3阳性细胞增殖速率与正常NIH 3T3细胞相比无明显差别;细胞凋亡检测表明转染DJ-1L166 P和DJ-1M26 I基因的NIH3T3阳性细胞凋亡率均高于正常NIH 3T3细胞,转染DJ-1基因的NIH 3T3阳性细胞凋亡率低于正常NIH 3T3细胞(P<0.05)。结论 DJ-1L166 P和DJ-1M26 I基因突变均降低NIH3T3细胞增殖速率,DJ-1L166 P和DJ-1M26 I基因突变更易导致NIH 3T3细胞的凋亡,DJ-1L166 P和DJ-1M26 I基因突变对NIH3T3细胞增殖速率和细胞凋亡影响是相似的。

BECN1与肿瘤关系的研究进展

BECN1是酵母自噬基因Atg6/Vps30的同系物,也是哺乳动物参与自噬的特异性基因,与肿瘤的发生发展密切相关。本文通过介绍BECN1的基本结构、相关作用蛋白及其相关自噬机制,总结了BECN1与自噬、凋亡及其肿瘤的关系,并探讨其在肿瘤治疗领域中的潜能。

SD大鼠超数排卵的优化

目的通过对鼠龄及激素剂量的控制研究其对SD大鼠排卵的影响。方法分别采用三种不同剂量PMSG／hCG组合（PMSG／hCG：20IU／20IU、25IU／25IU、30IU／30IU）对4、5、6周龄的SD大鼠进行超数排卵处理，以超数排卵总卵数、正常受精卵数、异型卵数作为评判标准，确定最佳超排剂量及鼠龄。结果20IU剂量时，三种周龄大鼠分别获取胚胎24．72枚、33．12枚、15．22枚，其中正常受精卵：21．58枚、29．1枚、13．1枚，异型卵：2．01枚、1．01枚、2．12枚；25IU剂量时，三种周龄大鼠分别获取胚胎37．63枚、43．62枚、20．78枚，其中正常受精卵22．67枚、38．6枚、18．5枚，异型卵：2．82枚、1．23枚、2．28枚；30IU剂量时，三种周龄大鼠分别获取胚胎51．69枚、61．36枚、30．2枚，其中正常受精卵47．2枚、60．8枚、25．6枚，异型卵：1．23枚、0．56枚、1．3枚。结论5周龄，激素剂量30Iu为大鼠超排的最适周龄及最佳激素剂量，为基因工程动物制备及胚胎冷冻实验提供技术保障。

pcDNA3．1／myc-His-DJ-1^M26I真核表达载体构建及其在NIH3T3细胞中表达

目的构建pcDNA3．1／myc-his-DJ-1和pcDNA3．1／myc-his-DJ-1^M26I重组表达载体，为进一步研究DJ-1^M26I基因的功能及建立转基因动物模型奠定基础。方法采用突变试剂盒将第26位氨基酸进行突变，分别构建pcDNA3．1／myc-his—DJ-1和pcDNA3．1／myc-his-DJ-1^M26I重组表达载体，采用脂质体转染的方法分别将pcDNA3．1／myc-his-DJ-1和pcDNA3．1／myc—his-DJ-1^M26I质粒转染NIH3T3细胞并用G418压力筛选稳定克隆，对获得的2种转染细胞在DNA水平、转录水平和蛋白质水平鉴定。结果pcDNA3．1／myc-his-DJ-1和pcDNA3．1／myc-his—DJ-1^M26I质粒转染NIH3T3细胞经G418筛选后，经PCR检测分别获得1个和3个阳性细胞克隆，RT-PCR及western blot方法进行DJ-1-His基因表达检测，结果均证明外源插入基因的表达，MTT实验结果初步证明转染DJ-1^M26I基因的NIH3T3阳性细胞组增殖速率低于正常NIH3T3细胞组（P〈0．05）。结论成功构建pcDNA3．1／myc-his-DJ-1和pcDNA3．1／myc-his-DJ-1^M26I重组表达质载体。

一种能实现蛋白可逆表达的敲入载体构建方法

在细胞或小鼠中使用Cre重组酶(Cyclization Recombination Enzyme,即环化重组酶)条件性地删除或修饰基因是不可逆的,基因删除后蛋白不能恢复表达。FK506-雷怕霉素结合蛋白FKBP L106P不稳定结构域(FKBP L106P destabilization domain)DD-C-Shield1系统可以解决这个问题,能人为控制蛋白表达或降解,避免胚胎致死。本实验以小GTP酶腺苷二磷酸核糖基化因子6(ADP-ribosylation factor 6,ARF6)为例,借助EL350细菌中Red/ET重组作用,使用DD-C-Shield1系统和重叠延伸PCR方法,发展一种通用的可实现蛋白可逆表达的构建敲入载体的方法。该方法缩短了构建时间,减少了重组的步骤,不需要使用rps L-neo DNA、链霉素和酶切位点。此敲入载体两侧同源臂5 kb左右,可用传统的ES打靶方法构建敲入小鼠,经过简单改造也可使用CRISPR/Cas9方法构建敲入细胞或小鼠模型,从而在细胞和动物模型中进行条件性修饰、快速、可逆地调节特异性蛋白表达,以利于发育学研究,为细胞和活体生物严谨调控蛋白功能提供了一种新的策略。