人LY6D基因真核表达载体的构建及蛋白的表达和定位

目的:构建人LY6D真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内的表达和定位。方法:提取HEK293T细胞的mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增LY6D基因的CDS序列,并将其亚克隆至pEGFP-C1表达载体中。进一步将构建的重组质粒进行酶切和测序鉴定,并转染到工具细胞HEK293T中,提取细胞总蛋白进行Western blot检测。然后利用激光扫描共聚焦显微镜观察LY6D在HEK293T细胞内的定位,最后Q-PCR检测过表达LY6D真核表达载体影响EMT关键基因的表达。结果:LY6D基因cDNA的编码区序列克隆到了真核表达载体pEGFP-C1中,酶切鉴定片断为387 bp,并进一步测序成功。Western blot检测到了pEGFP-LY6D融合蛋白的表达,分子量约为41 kDa。pEGFP-LY6D融合蛋白在HEK293T细胞中主要定位于细胞膜和细胞质。过表达LY6D真核表达载体减少E-cadherin的表达。结论:成功构建了LY6D基因cDNA的CDS序列的真核表达载体,pEGFP-LY6D蛋白在HEK293T细胞中主要定位于细胞膜和细胞质,LY6D过表达可以降低E-cadherin的表达。