邻苯二甲酸二异丁酯——新型的ANO2通道开放剂

目的筛选ANO2的特异性配体药物,为医药行业开发靶向ANO2新药提供先导化合物的结构信息。方法构建ANO2过表达的HEK293细胞株,应用共聚焦显微镜-膜片钳全细胞记录模式技术筛选ANO2的特异性配体。结果在胞内外钳制电压100 mV及含1μmol·L^(-1)钙离子电极内液的记录条件下,邻苯二甲酸二异丁酯(diisobutyl phthalate,DIBP)给药前ANO2介导的氯电流密度为(14.67±2.87)pA/pF,给药后ANO2介导的氯电流电导为(28.75±4.05)pA/pF,差异具有统计学意义(P<0.01);钙荧光成像实验结果表明DIBP无调节胞内游离钙信号的作用;在0μmol·L^(-1)钙离子条件下,DIBP对静息状态的ANO2通道不具有直接的激活作用。结论DIBP通过直接作用增强已活化ANO2通道的电导,其作为一种新型的促ANO2通道开放剂为开发靶向ANO2的药物提供结构信息,同时也为研究其他邻苯二甲酸酯类物质的毒理作用提供一定的理论基础。

P2RX7和组蛋白修饰变化在曲古抑菌素A缓解烟草烟雾暴露所致小鼠卵巢损伤中的作用

目的探索P2RX7和组蛋白修饰变化在曲古抑菌素A(TSA)抑制NLRP3缓解烟草烟雾(CS)暴露所致的小鼠卵巢损伤过程中的作用。方法通过CS暴露30 d方法制备小鼠卵巢损伤模型,给予TSA进行治疗;HE染色观察各组小鼠卵巢组织形态;Western blot技术检测各组小鼠卵巢组织组蛋白去乙酰化酶(HDAC)1、HDAC2、NLR家族Pyrin域蛋白3(NLRP3)、P2RX7、Zeste同源物增强子2(EZH2)表达以及H3K4me1、H3K4me2、H3K27me3和H3K9ac总的修饰水平变化。结果与control组相比,CS组小鼠卵巢总体积减小,卵泡总数减少,卵巢皮质发生萎缩,TSA可有效抑制CS暴露引起的小鼠卵巢组织形态结构改变。CS组小鼠卵巢组织中HDAC1、HDAC2、NLRP3和P2RX7表达水平较control组明显升高,TSA有效抑制了CS暴露激活的小鼠卵巢组织HDAC1、HDAC2及焦亡相关蛋白NLRP3和P2RX7的表达(P<0.05)。CS暴露后小鼠卵巢组织总H3K4me1、H3K4me2和H3K9ac表达水平明显升高,TSA有效抑制了CS暴露诱导的小鼠卵巢组织总H3K4me1、H3K4me2和H3K9ac的表达上调(P<0.05)。结论P2RX7和组蛋白修饰变化参与CS暴露所致的卵巢NLRP3炎性小体的激活以及TSA缓解卵巢损伤的过程。

应用CRISPR/Cas9技术构建内源表达双标签NPM1融合蛋白的细胞系

目的 旨在创建一个内源表达NPM-Stag-Flag融合蛋白的细胞模型,为精确分离和鉴定未知NPM1互作蛋白奠定基础。方法 结合CRISPR/Cas9基因编辑技术并利用同源重组机制在内源NPM1基因位点敲入编码Stag-Flag的序列,通过药物筛选分离和鉴定单克隆细胞。结果 成功建立了两种纯合型敲入Stag-Flag的人T淋巴瘤JurkatE6-1细胞系。在C-端插入Stag-Flag标签的NPM1表达效率明显优于N-端插入型。利用双标签的两步亲和纯化法可有效富集到NPM1蛋白复合物。结论 内源表达NPM1-Stag-Flag的JurkatE6-1细胞系是今后寻找未知NPM1互作分子和开展功能研究的有力工具。

PKC介导单核/巨噬细胞分化过程中间质标志物的表达变化

目的探讨单核/巨噬细胞分化过程中,PKC调控间质标志物表达变化的机制。方法以PMA诱导的单核细胞分化成巨噬细胞过程为研究对象,利用流式细胞术检测巨噬细胞表面标志物的表达;随后利用鬼笔环肽染色比较分化前后细胞长短轴的比例变化;利用Western blot法检测分化前后间质标志物相关蛋白的表达变化以及PKC抑制剂对间质标志物表达的影响。结果单核细胞向巨噬细胞分化过程中,间质标志物表达增加,并且这种变化受到PKC的调控。结论PKC介导单核/巨噬细胞分化过程中间质标志物的表达变化。

核仁磷酸蛋白基因NPM1敲除人宫颈癌细胞株的构建及功能

目的通过CRISPR/Cas9系统定向敲除人类宫颈癌细胞(HELA)的核仁磷酸蛋白1基因(nucleophosmin1,NPM1),探讨敲除对HELA细胞生物学行为的影响。方法利用http://crispr.mit.edusgRNA在线设计工具设计sgRNA,通过T7E1系统筛选合适的sgRNA,将设计好的质粒通过转染的方式转入HELA细胞株,通过博来霉素(zeocin)抗生素进行筛选,通过Westernblot,PCR,基因测序等手段确认敲除细胞系的建立,通过免疫荧光的方式观察敲除细胞株。结果T7E1酶切PCR退火产物之后琼脂糖凝胶结果表明,CRISPR/Cas9系统对HELA细胞基因组进行了切割,并在同源重组时发生了碱基错配;Westernblot结果说明基因敲除后NPM1蛋白表达消失;基因测序的结果表明敲除细胞系建立的成功;免疫荧光的结果表明该细胞系出现异常核仁现象。结论NPM1敲除后细胞核仁异常,可能影响细胞正常生命进程。

β-榄香烯抑制恶性黑色素瘤生长和侵袭

目的研究β-榄香烯(β-E)对恶性黑色素瘤细胞B16增殖和侵袭的影响及其相关机制。方法培养B16细胞,建立体外恶性黑色素瘤模型,应用MTT法检测β-E对B16细胞增殖能力的影响,应用Transwell方法检测β-E对B16细胞侵袭能力的影响,应用qRT-PCR和western-blot检测β-E对B16细胞MMP2mRNA和蛋白表达的影响。结果成功建立体外恶性黑色素瘤模型,β-E显著抑制B16细胞增殖和侵袭能力,抑制B16细胞中MMP2mRNA和蛋白表达,DDP也显著下调上述指标,且以上指标中与DDP组没有显著性差异。结论β-E显著抑制B16细胞增殖和侵袭能力,降低MMP2表达,提示β-E可能在抑制B16细胞增殖和侵袭能力过程中起重要作用。

MIAT过表达载体的构建及其对血肿瘤屏障通透性的影响

目的构建长链非编码RNA心肌梗死相关转录物(MIAT)过表达载体pcDNA3.1-MIAT,并研究其对血肿瘤屏障通透性影响。方法从与脑胶质细胞U87共培养的人脑微血管内皮细胞hCMEC/D3(GECs)提取总RNA,用反转录聚合酶链式反应技术扩增出MIAT基因片段,通过无缝连接技术克隆到pcDNA3.1载体中进行序列分析,转染重组质粒pcDNA3.1-MIAT到GECs中,real-time PCR检测转染效率,应用跨内皮电阻测量系统和辣根过氧化物酶渗漏实验分析血肿瘤屏障通透性的变化。结果成功扩增出MIAT基因,成功构建pcDNA3.1-MIAT表达载体,Blast序列分析与GenBank中NR00349一致。转染pcDNA3.1-MIAT后,96h转染效率最高,过表达MIAT组跨内皮阻抗值最低,辣根过氧化物酶流量最高,血肿瘤屏障通透性最高。结论成功构建pcDNA3.1-MIAT表达载体,过表达MIAT使血肿瘤屏障通透性升高。

β-榄香烯抑制B16恶性黑色素瘤细胞的EPHA2表达和血管生成拟态

目的研究β-E对B16恶性黑色素瘤细胞上皮细胞激酶(epithelial cell kinase,EphA2)表达和血管生成拟态的影响及其相关机制。方法培养B16细胞,建立体外恶性黑色素瘤模型,应用qRT-PCR法和Western-blot法检测β-E对B16细胞EPHA2mRNA和蛋白表达影响,应用Matrigel诱导血管生成实验检测β-E对B16细胞血管生成拟态生成能力的影响。结果成功建立体外恶性黑色素瘤模型,β-E显著抑制B16细胞EPHA2mRNA和蛋白表达,抑制B16细胞血管生成拟态生成能力。结论β-E可在治疗恶性黑色素瘤中起重要作用。