面神经损伤后MnTBAP对面神经元的保护作用

目的观察锰苯甲酸卟啉(MnTBAP)对大鼠面神经挤压伤后神经元的保护作用及对caspase-3表达的影响。方法制作大鼠双侧面神经总干挤压伤模型,左侧损伤局部给予MnTBAP,右侧给予生理盐水作为对照。于伤后1,3,7,14,28,42 d时,观察大鼠面瘫恢复情况;HE染色观测术后面神经元的形态学变化;免疫组化检测caspase-3表达的变化。结果 MnTBAP对总干挤压伤后的面神经有明显的功能恢复作用;伤后第3日开始,MnTBAP侧和对照侧面神经元存活率逐渐下降,第7日开始,MnTBAP侧面神经元存活率明显高于对照侧(P<0.05);伤后第3日,caspase-3表达增加,第14日时达高峰,各时间点表达水平MnTBAP侧低于对照侧(P<0.05)。结论 MnTBAP有助于挤压伤后面神经功能恢复,降低caspase-3的表达、抑制细胞凋亡可能是MnTBAP治疗创伤性面瘫的重要机制之一。

小鼠3D3／LYRIC基因重组质粒构建及蛋白表达和定位

目的构建小鼠3D3/LYRIC真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位。方法提取小鼠乳腺上皮细胞系C127的mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增m3D3/LYRIC全长编码基因,亚克隆至pEGFP-C1表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到腺样囊性癌细胞系ACC-2中,提取细胞蛋白进行Western blot检测。利用免疫荧光显微镜观察pEGFP-m3D3/LYRIC在腺样囊性癌ACC-2细胞内的定位。结果 m3D3/LYRIC全长基因序列克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,酶切鉴定片段大小为1 740 bp。Western blot检测到融合蛋白GFP-m3D3/LYRIC表达,分子量约为91 kDa。pEGFP-C1-m3D3/LYRIC主要在细胞质内定位,在细胞核内未见表达。结论成功构建了m3D3/LYRIC全长基因真核表达载体,pEGFP-m3D3/LYRIC蛋白主要定位于细胞质内。

骨肉瘤细胞中SORBS1的表达和定位

目的构建人SORBS1真核表达载体并检测在骨肉瘤细胞内的表达及定位。方法以GST-hSORBS1为模板,利用PCR扩增hSORBS1基因cDNA全长,并将其克隆至3*Flag标签的真核表达载体中。进一步将构建的重组载体进行酶切和测序鉴定,并转染到骨肉瘤细胞MG-63中,提取蛋白进行Western blot检测。同时利用共聚焦激光显微镜观察3*Flag-hSORBS1在MG-63细胞中的定位,使用免疫沉淀的方法纯化hSORBS1蛋白。结果hSORBS1基因cDNA全长成功构建到真核表达载体3*Flag中,Western blot检测到3*Flag-hSORBS1融合蛋白表达,且在骨肉瘤细胞MG-63中主要定位于细胞周边,并成功纯化hSORBS1蛋白。结论成功构建3*Flag-hSORBS1真核表达质粒,同时鉴定其融合蛋白的表达,并纯化hSORBS1蛋白。3*Flag-hSORBS1蛋白主要定位在细胞周边。