腺病毒介导的TSP-1f基因转移抑制视网膜新生血管的实验研究

目的构建表达凝血酶敏感蛋白-1(thrombin sensitive protein-1,TSP-1)抗新生血管活性片段(TSP-1f)腺病毒载体,并观察其对氧诱导的小鼠视网膜新生血管形成的抑制作用。方法应用RT-PCR方法从正常人外周血单个核细胞扩增TSP-1fcDNA序列;采用AdEasy系统构建TSP-1f重组腺病毒ADV-TSP-1f。将鼠龄为7d的40只C57BL/6J新生鼠置于体积分数75%的氧环境中连续生活5d,然后回到正常环境中建立氧诱导的鼠血管增生性视网膜病变动物模型;每只鼠随机选取一眼为实验组,而对侧眼为对照组,在鼠生后12d时实验组玻璃体腔注射ADV-TSP-1f,对照组注射ADV-LacZ。1周后麻醉处死小鼠,Western印迹方法检测TSP-1f在实验组视网膜中的表达;视网膜铺片ADP酶法观察视网膜血管变化,组织学切片观察比较突破视网膜内界膜的血管内皮细胞数量。结果成功构建表达TSP-1f重组腺病毒载体并转染鼠视网膜,Western blotting检测到实验组视网膜目的基因表达。视网膜铺片实验组视网膜未见明显的无灌注区形成,新生血管几乎消失。组织切片实验组突破内界膜的内皮细胞核数目(10.18±1.74)明显减少,与对照组(48.89±2.98)相比差异有显著统计学意义(P<0.01)。结论腺病毒介导的TSP-1f对氧诱导的鼠视网膜新生血管有显著的抑制作用,为视网膜新生血管性疾病的基因治疗奠定基础。

Survivin、COX-2蛋白在肺腺癌中的表达及意义

目的探讨肺腺癌组织中Survivin、COX-2蛋白表达与临床病理特征的关系及其相关性。方法用SP免疫组化法检测38例肺腺癌组织和16例良性病变肺组织中Survivin、COX-2蛋白的表达。结果Sur-vivin、COX-2蛋白的阳性率在38例肺腺癌中分别为55.3%、71.1%,与良性病变肺组织相比,差异有显著性(P值均<0.01)。Survivin蛋白的阳性率在III+IV期肺腺癌高于I+II期(P<0.05),其表达与患者的年龄、性别、肿块大小、分化程度及淋巴结转移与否无关(P>0.05)。COX-2蛋白表达与患者临床病理特征均无关。Survivin、COX-2蛋白在肺腺癌中的表达呈正相关。结论Survivin、COX-2蛋白在肺腺癌组织中表达上调且呈正相关,二者在肺腺癌的发生发展中可能具有协同作用,有望作为靶点用于肺腺癌的靶向治疗。

自噬相关基因Bcelin-1与凋亡相关基因Bcl-2在舌鳞状细胞癌中的表达与意义

目的探讨自噬相关基因Beclin-1与凋亡相关基因Bcl-2在口腔舌鳞状细胞癌(TSCC)及正常舌组织中的表达及相关性。方法采用免疫组化方法检测43例舌癌手术标本及20例正常舌组织标本中Beclin-1与Bcl-2的表达。结果在TSCC中,Beclin-1的阳性表达率(37.2%)明显低于正常涎腺组织(95.0%),而Bcl-2的阳性表达率(69.8%)明显高于正常涎腺组织(30.0%),差异均有统计学意义(P<0.01)。TSCC中,Beclin-1低表达在有、无颈部淋巴结转移方面,差异有统计学意义(P<0.01);而Bcl-2高表达在有、无颈部淋巴结转移方面,差异有统计学意义(P<0.01)。Beclin-1与Bcl-2在TSCC中表达呈负相关(r=-0.265,P=0.006)。结论 Beclin-1与Bcl-2与舌鳞状细胞癌的发生、发展中密切相关。

SD大鼠力竭游泳骨骼肌^(31)P-MRS与Desmin表达相关性的研究

目的研究不同负荷游泳运动后SD大鼠骨骼肌31P-MRS的变化,以及与Desmin表达的相关性。方法将45只健康雄性SD大鼠随机分成3组:正常组(C组)、半力竭游泳组(HE组)、力竭游泳组(E组),麻醉后进行右下肢骨骼肌31P-MRS采集,测量Pi、PCr、ATP峰下面积并计算Pi/PCr、Pi/ATP、PCr/ATP。扫描后立即处死取材,常规组织学检查,并用免疫组化法进行Desmin染色,测算平均光密度值(OD值)。结果C组Pi、PCr、ATP峰下面积分别为0.16±0.05、1.33±0.62、0.41±0.06,Pi/PCr、Pi/ATP、PCr/ATP分别为0.14±0.08、0.39±0.13、3.28±1.62。光镜下,肌细胞形态规整,排列整齐。OD值为0.55±0.04;HE组Pi、PCr、ATP峰下面积分别为0.33±0.16、0.90±0.20、0.79±0.35,Pi/PCr、Pi/ATP、PCr/ATP分别为0.40±0.17、0.54±0.40、1.48±1.09。光镜下,HE组肌细胞水肿,肌丝分离,排列稀疏。OD值为0.32±0.01;E组Pi、PCr、ATP峰下面积分别为0.49±0.21、0.52±0.09、0.19±0.07,Pi/PCr、Pi/ATP、PCr/ATP分别为0.99±0.45、3.08±1.88、3.15±1.33。光镜下,E组部分肌丝断裂,皱缩。OD值为0.21±0.02;3组大鼠Pi、PCr、ATP及Pi/PCr存在组间差异性,Pi/ATP正常组与半力竭组无差异,PCr/ATP正常组与力竭组无差异。Pi、PCr、ATP、Pi/PCr、Pi/ATP与OD值相关系数依次为0.621、0.775、0.127、-0.75和0.583,均具有统计学意义(P<0.01)。PCr/ATP与OD值相关系数无统计学意义(P>0.05)。结论31P-MRS能够有效评价SD大鼠骨骼肌力竭性损伤,PCr峰下面积及Pi/PCr比值可作为检测骨骼肌力竭损伤的观察指标,且与病理分析具有相关性,因此能够定量定性分析骨骼肌损伤程度。

基底细胞癌中MMP-2、TIMP-4表达的研究

目的探讨基质金属蛋白酶2(MMP-2)、组织金属蛋白酶抑制剂4(TIMP-4)在基底细胞癌(BCC)中的表达及意义。方法原位杂交法检测MMP-2和TIMP-4在15例BCC及10例正常皮肤中的表达,采用图像分析技术对原位杂交结果进行定量分析。结果BCC癌旁间质MMP-2表达较正常皮肤真皮增高(t=6.71,P<0.01),癌旁间质TIMP-4表达较正常皮肤真皮增高(t=8.65,P<0.01),癌旁间质TIMP-4/MMP-2比值较正常皮肤真皮增高(t=2.52,P<0.05)。部分BCC癌细胞有MMP-2表达,未见癌细胞有TIMP-4明显表达。正常人皮肤表皮无MMP-2和TIMP-4表达,正常人皮肤真皮仅见MMP-2和TIMP-4的弱阳性或阴性表达。结论MMP-2的表达可能与基底细胞癌的生长和侵袭有关;TIMP-4可能抑制MMP-2的活性,从而抑制BCC的侵袭和转移;TIMP-4/MMP-2比值升高可能是抑制BCC侵袭和转移的重要机制。

Livin、Smac在上皮性卵巢癌中的表达及意义

目的:探讨凋亡抑制蛋白Livin和凋亡促进因子Smac与上皮性卵巢癌临床病理学特征的关系。方法:利用免疫组化技术SABC法检测50例上皮性卵巢癌、20例良性卵巢瘤和20例正常卵巢组织中Livin和Smac的表达情况。结果:Livin在卵巢恶性肿瘤中的表达明显高于正常卵巢组织和卵巢良性肿瘤组织。在上皮性卵巢癌组织中,Livin的表达与组织病理学分级成正相关,与分期无关;Smac在卵巢癌中的表达低于良性卵巢瘤及正常卵巢组织,与组织病理学分级、分期成负相关,表达出现逐渐降低的趋势。结论:Livin表达升高和Smac表达降低在上皮性卵巢癌的发生、分化进展过程中起重要作用。Livin和Smac基因有可能成为治疗卵巢癌的新靶标。

盘状结构域受体1与基质金属蛋白酶2在唾液腺腺样囊性癌中的表达及意义

目的:检测唾液腺腺样囊性癌(salivary gland adenoid cystic carcinoma,SACC)组织中盘状结构域受体1(discoidin domain receptor 1,DDR1)与基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP2)的表达,探讨两者在SACC中的表达意义及相关性。方法:应用SP免疫组织化学方法检测54例SACC标本和30例正常唾液腺组织中DDR1与MMP2的表达情况。采用SPSS13.0软件包对数据进行统计学分析。结果:DDR1在SACC中的阳性表达率为87.0%,显著高于正常唾液腺组织(10%,P<0.01)。DDR1的高表达与SACC的神经侵袭、淋巴结转移相关(P<0.05)。MMP2在SACC中的阳性表达率为68.5%,显著高于正常唾液腺组织(13.3%,P<0.01)。经Spearman等级相关分析,DDR1与MMP2呈现显著正相关(r=0.332,P<0.05)。结论:在SACC中,DDR1与MMP2共同高表达,与SACC的发生与发展相关。

人胃癌Runx3基因CpG岛甲基化的关键位点和演进

目的:研究人胃癌Runx3基因CpG岛甲基化的关键位点和演进.方法:应用MSP法和Western blot法分别检测26例人胃癌和相应的癌旁正常组织标本Runx3基因CpG岛从5′区向转录起始点方向连续6个位点的甲基化状态和Runx3蛋白的表达.结果:根据MSP的结果计算出上述连续6个位点的甲基化阳性率,结果随着向转录起始点方向的演进,各位点甲基化的阳性率逐渐降低,胃癌组和癌旁组从第3位点开始出现差异,至第5和第6位点差异显著(P<0.05);按照胃癌分化程度分组,低分化组与高分化组在3-6位点差异显著(P<0.05).胃癌组与癌旁组Runx3蛋白表达水平(0.499±0.106 vs 0.721±0.080)以及低分化组与高分化组(0.437±0.053 vs 0.617±0.073)Runx3蛋白表达水平均存在显著差异(P<0.01).结论:人胃癌Runx3基因CpG岛的甲基化从5′区向转录起始点方向演进,甲基化的演进与肿瘤的分化程度有关;转录起始点部位可能为Runx3基因甲基化的关键位点.

腺病毒介导的PEDF基因转移对脐静脉血管内皮细胞的作用

目的研究腺病毒介导的色素上皮衍生因子(adenovirus pigment epithelium-de-rived factor,Ad-PEDF)对体外培养的血管内皮细胞增生及凋亡的作用。方法采用MTT法观察PEDF基因对人脐静脉血管内皮细胞ECV304的体外细胞增生的影响。TUNEL染色、流式细胞仪AnnexinV/碘化丙啶双染法,检测腺病毒介导的PEDF基因作用后人脐静脉血管内皮细胞的凋亡。结果Ad-PEDF(感染复数分别为25和50)作用72h后,ECV304细胞数显著少于PBS组和Ad-LacZ组(P<0.05);TUNEL染色,ECV304细胞出现典型的凋亡形态学改变。以感染复数为50的Ad-PEDF处理ECV304细胞72h后,细胞凋亡率为(26.51±1.54)%,PBS组为(2.90±0.79)%,Ad-LacZ组为(3.28±0.73)%,Ad-PEDF组与Ad-LacZ组、PBS组相比差异均有显著统计学意义(P<0.01)。结论腺病毒介导的PEDF基因可显著抑制人脐静脉血管内皮细胞ECV304的体外细胞增生,同时对人脐静脉血管内皮细胞的凋亡具有诱导作用。

肥厚性扁平苔藓皮损中浸润淋巴细胞的研究

目的探讨淋巴细胞浸润在肥厚性扁平苔藓发病机制中的意义。方法采用免疫组织化学SP法对10例肥厚性扁平苔藓患者皮损、20例非肥厚性扁平苔藓患者皮损及10例正常人皮肤中CD3、CD4、CD8、CD20进行检测。结果所有患者皮损均以CD3+T、CD4+T、CD8+T细胞浸润为主,散在CD20+B细胞浸润。肥厚性皮损中浸润T淋巴细胞数少于非肥厚性皮损(P(0.01),CD20+B细胞占浸润淋巴细胞百分率高于非肥厚性皮损(P<0.05)。正常人皮肤仅在真皮偶见CD3+T细胞。结论肥厚性扁平苔藓皮损T淋巴细胞的减少,B淋巴细胞的增多表达可能与疾病的持续存在及局部过度增殖性改变密切相关。

Livin基因RNAi表达载体的构建及其沉默效应观察

目的:构建针对人Livin基因的短发夹状小干扰RNA(shRNA)表达载体,并观察该载体对Livin基因表达的沉默效应。方法:设计并合成4个Livin靶向的发夹状siRNA靶序列,退火后分别连接入pGCL-GFP慢病毒表达载体,转化,扩增后测序。以含有Livin基因的质粒为模板,扩增Livin基因cDNA序列的特异性片段,连接,克隆入真核表达载体pdsRED2-N1-3FLAG。将构建好的Livin基因过表达克隆质粒和不同靶点的RNAi表达载体质粒,经lipfectamine2000包裹,共转染入人293T细胞,Western blot和荧光显微镜检测Livin蛋白的表达情况,判断不同靶点的干扰效果。结果:Livin基因RNAi的表达载体pGCL-GFP-shLivin和Livin基因过表达载体pdsRED2-N1-Livin的阳性克隆序列正确。人293T细胞Livin蛋白表达90%被阻断。结论:成功构建高效阻断Livin基因表达的RNAi慢病毒表达载体,为应用RNAi进一步研究Livin基因的生物学功能奠定基础。

经脐单孔腹腔镜治疗小儿复杂性阑尾炎的疗效分析

目的分析经脐单孔腹腔镜术(UOTLA)治疗小儿复杂性阑尾炎的疗效。方法总结2012年1月-2015年10月在该院治疗的78例复杂性阑尾炎患者临床资料,其中单孔腹腔镜手术的44例患者为UOTLA组,开腹手术治疗的34例患者为开腹阑尾切除术组(OA),对两组患者的手术时间、术后住院时间、术后腹腔脓肿、切口感染、早期炎性肠梗阻和疼痛程度等指标进行统计分析。结果化验指标中C反应蛋白(CRP)在两组中无明显差异,外周血白细胞总数(WBC)在腹腔镜组下降较开腹组明显;手术相关指标中,UOTLA组手术时间较OA组缩短,但差异无统计学意义[(66.59±33.24)vs(72.86±30.36)min,P>0.05],术后住院时间更短[(8.21±1.67)vs(9.21±2.01)d,P<0.05]。术后腹腔脓肿UOTLA组3例,OA组1例(P>0.05);切口感染:UOTLA组6例,OA组9例(P>0.05);早期炎性肠梗阻:UOTLA组1例,OA组5例(P>0.05);疼痛程度比较,UOTLA组较OA组术后恢复正常活动时间明显缩短(P<0.05),UOTLA组的平均住院费用与OA组比较,差异无统计学意义[(10 639.37±2 970.92)vs(10 765.04±2 902.64)元,P>0.05]。结论 UOTLA治疗小儿复杂性阑尾炎不但具有创伤小、恢复快、住院时间短和美容效果等优点,而且并没有明显增加手术费用,术后并发症也没有明显增加,是一种安全有效的手术方式,可用于治疗小儿化脓穿孔性阑尾炎及坏疽穿孔性阑尾炎等相对复杂的阑尾炎。

谷氨酰胺对内毒素血症幼年大鼠小肠上皮ERK-2及P38活性影响

目的观察谷氨酰胺(Gln)对幼年大鼠内毒素血症时小肠上皮信号转导通路ERK、P38活性的影响,探讨谷氨酰胺对内毒素血症幼年大鼠小肠上皮的保护机制。方法选清洁级18日龄Wistar大鼠90只,按腹腔注射药物不同、注射时间不同分为:生理盐水组(NS组,n=10),内毒素组(LPS组,n=40),谷氨酰胺组(Gln组,n=40);后两组又分为2,6,24及72 h共4个时间点,每个时间点10只,在各指定时间点免疫组化方法确定ERK-2以及P38蛋白的表达。结果 LPS组各时点ERK-2,P38蛋白表达均较NS组增强,差异有统计学意义(P<0.01);Gln组各时点ERK-2,P38蛋白表达趋势与LPS组一致,但明显低于LPS组(P<0.05);且各组ERK-2表达均比P38明显增强,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 ERK-2、P38信号转导通路在内毒素血症表达均明显增强,谷氨酰胺可使其表达下调,且ERK-2表达比P38明显增强,很有可能ERK-2比P38在内毒素血症中及谷氨酰胺保护小肠损伤机制上更占有主要地位。

马凡综合征一家系的致病基因筛查

目的:对中国辽宁省一个具有常染色体显性遗传特点的马凡综合征(Marfan syndrome,MFS)家系进行突变基因的筛查。方法:分别采集家系成员的外周静脉血,提取基因组DNA,通过对与马凡综合征相关的致病基因进行遗传学研究和分析,选取候选基因并设计引物,应用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段后进行琼脂糖凝胶电泳分离,利用直接测序法确定致病基因及其突变位点。结果:该家系遗传方式符合常染色体显性遗传,先证者表型为双眼晶状体向鼻上方脱位,通过对候选基因外显子直接测序,发现该家系内患者原纤维蛋白基因-1(fibrillin-1 gene,FBN1)第7个外显子第640位碱基有1个A>G的点突变,此突变导致蛋白第214位的甘氨酸被丝氨酸取代(G214S)。结论:FBN1基因c.A640G(p.G214S)突变为该马凡综合征家系的致病因素。

TGF-β1影响肺成纤维细胞结缔组织生长因子基因表达的研究

目的研究转化生长因子-β1(TGF-β1)对体外培养早产鼠的肺成纤维细胞(LFs)结缔组织生长因子(CTGF)基因表达的影响。方法以孕19dWistar大鼠剖宫取出的仔鼠为对象,原代培养LFs,实验组分别采用不同浓度(1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL)和不同作用时间(12h、24h、48h)TGF-β1刺激LFs,对照组无血清培养基培养(即0ng/mL)。应用RT-PCR方法检测LFs的CTGFmRNA表达。结果与对照组比较,实验组LFs的CTGFmRNA水平增高(P<0.05),且随TGF-β1作用浓度的增加、作用时间的延长CTGFmRNA表达逐渐上升,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 TGF-β1能刺激肺成纤维细胞中CTGF基因表达,并且以剂量和时间依赖方式上调CTGF基因表达。

异常出生体重胎儿父系表达基因1和3的表达与启动子区甲基化及其意义

目的研究印记基因父系表达基因1（paternally expressed gene1，PEG1）与父系表达基因3（paternally expressed gene 3，PEG3）在无妊娠并发症孕妇分娩的异常出生体重儿胎盘组织中的mRNA表达和启动子区甲基化及其意义。方法应用实时定量PCR技术和基因组DNA亚硫酸氢钠处理后直接测序法检测高出生体重组（出生体重≥4000g，22例）、低出生体重组（出生体重≤2500g，14例）和正常出生体重组（出生体重〉2500g且〈4000g，24例）胎盘组织中PEG1与PEG3的mRNA表达和启动子区甲基化，并分析其与出生体重的关系。结果（1）PEGl与PEG3mRNA表达水平：高出生体重组分别为11．66±9．01与16．45±10．13，低出生体重组0．84±0．49与0．85±0．67，正常出生体重组1．10±0．77与1．11±0．60。两基因高出生体重组与正常出生体重组比较，差异均有统计学意义（P〈0．05），低出生体重组与正常出生体重组比较，差异均无统计学意义（P〉0．05）；（2）PEGl启动子区甲基化水平：高出生体重组为（49．7±2．3）％，低出生体重组为（50．2±2．1）％，正常出生体重组为（50．3±1．9）％（P〉0．05）；PEG3启动子区甲基化水平，高出生体重组为（13．1±2．7）％，低出牛体重组为（16．7±3．5）％，正常出生体重组为（16．2±1．8）％，仅高出生体重组与正常出生体重组之间差异有统计学意义（P〈0．05），但正常出生体重组与低出生体重组之间差异无统计学意义（P〉0．05）；（3）PEG3mRNA的表达与启动子区甲基化水平呈负相关（r=-0．963，P〈0．01）。结论PEG1和PEG3的表达上调可能是发生高出生体重儿的原因之一，PEG3的启动子区甲基化水平的降低可能参与其表达上调，并且可能与高出生体重的产生相关。

线粒体转录因子A在肾细胞癌中的表达

目的检测线粒体转录因子A（TFAM）在肾细胞癌中的表达，探讨其与肾细胞癌发生发展的关系。方法选取2009年1月至2010年6月在我院行肾细胞癌手术患者97例。采用免疫组织化方法对。肾细胞癌及癌旁组织中TFAM蛋白的表达进行检测，观察TFAM的表达与肾细胞癌病理分级、临床分期、淋巴结转移及预后的关系。结果TFAM在肾细胞癌中的表达率（38．1％）明显高于癌旁组织（5．0％），差异有统计学意义（P〈0．01）。TFAM蛋白异常表达与肾细胞癌临床分期、病理分级、淋巴结转移有关，即肾细胞癌临床分期越高、病理分级越高、淋巴结转移时，TFAM表达越明显，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论TFAM的表达异常可能是肾细胞癌发生发展的分子机制之一。

hLMO3基因全长及截短序列原核表达载体的构建及蛋白诱导表达

目的构建hLMO3原核全长及5个截短表达载体并鉴定融合蛋白的表达。方法提取工具细胞HEK293的mRNA,反转录为cDNA,PCR扩增hLMO3全长及截短编码基因,亚克隆至GST融合表达载体pGEX-5X-2中。在E.coli BL21中诱导GST-hLMO3全长及截短融合蛋白表达,并经免疫印迹鉴定结果。结果 hLMO3全长及5个截短基因序列克隆到了原核表达载体pGEX-5X-2中,并经测序鉴定正确。Westernblot在E.coli Bl21中检测到了相应融合蛋白的表达。结论成功构建hLMO3全长及5个截短基因序列原核表达载体,在E.coli BL21中诱导表达出GST-LMO3全长及截短融合蛋白。

荧光定量PCR在小儿肺炎支原体感染早期诊断中的临床应用

目的探讨荧光定量PCR检测在肺炎支原体感染的早期诊断价值及临床意义。方法分别用咽拭子荧光定量PCR法和明胶颗粒凝集法检测122例下呼吸道感染患儿肺炎支原体感染情况并对两种检测方法进行比较。结果与明胶颗粒凝集法相比，荧光定量PCR法有较高的敏感性（86．7％）和特异性（91．3％）。在首次滴度〈1：160的110例患儿中，荧光定量PCR法检测阳性病例与第二次血清滴度呈4倍以上升高的病例符合率为90．9％。两种方法均在检测6岁以上儿童时阳性率最高；在婴幼儿组，荧光定量PCR法阳性率高于明胶颗粒凝集法，但差异无显著性（χ^2=2．29，P〉0．05）。结论荧光定量PCR法敏感度高，特异性强，操作简单，可以准确定量，可作为早期快速诊断儿童（尤其3岁以下患儿）肺炎支原体感染的方法。