急性白血病死亡相关蛋白激酶基因表达及启动子区甲基化状态研究

本研究通过对急性白血病病人及体外肿瘤细胞株的DNA甲基化及基因表达的实验,探讨死亡相关蛋白激酶(death-associated protein kinase,DAPK)基因在急性白血病中的表达情况及其启动子区域甲基化的状态,并分析两者之间的相关程度。应用RT-PCR检测DAPK基因在白血病细胞及正常骨髓细胞中的表达;用巢式甲基化特异性PCR(n-MSP)法检测急性白血病患者及细胞株DAPK基因启动子甲基化状况;从第二轮巢式MSP扩增出的随机产物中挑选2个随机引物,交予专业机构克隆后进行序列分析。结果表明:DAPK基因在10例正常对照者骨髓标本中均有表达,DAPK mRNA在急性白血病病人骨髓标本中表达平均值为0.61±0.40,低于正常对照者,差异有显著性(P<0.05),其中52.94%(9/17例)的急性淋巴细胞白血病病人骨髓标本DAPK mRNA表达降低或缺失,急性髓系白血病病人数据为41.18%(42/102);细胞株U-937显示基因表达正常,HL-60表达缺失;102例急性髓系白血病病人骨髓标本中33例存在DAPK启动子区甲基化,甲基化率为32.4%(33/102);17例急性淋巴细胞白血病病人骨髓标本中8例存在DAPK启动子区甲基化,甲基化率为47%(8/17);7例正常人骨髓标本DAPK启动子区均为非甲基化;细胞株U-937 DAPK启动子区非甲基化,HL-60 DAPK启动子区甲基化。ALL组与AML组患者骨髓细胞DAPK mRNA表达与其启动子甲基化均呈显著负相关(ALL组r=-0.855,P<0.05;AML组r=-0.343,P<0.05),提示两者有密切的关联。结论:急性白血病患者中DAPK基因启动区甲基化与其mRNA的异常表达或失表达有关。

RNA干扰沉默蛋白激酶B基因表达对移植静脉内膜增生的影响

目的观察纳米粒子包载的靶向蛋白激酶B(PKB)基因的shRNA表达载体局部转染对大鼠移植静脉内膜增生的影响。方法应用聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)和聚乙烯醇(PVA)包载PKB的RNA干扰基因载体,制备纳米级粒子混合物。建立自体颈静脉-颈总动脉移植模型共72只,随机分成转基因组、空载体组和对照组。分别于术后3,7,14,28 d取材;常规HE及Verhoeff染色,用North-ern blot和Western blot检测PKB基因的mRNA及蛋白的变化,HE和Verhoeff染色观察内膜厚度,TUNEL法观察血管平滑肌细胞(VSMC)凋亡的动态变化。结果转基因组内膜中PKB基因的mRNA及蛋白产物表达较其他两组明显减少(P<0.05);术后7,14,28 d转基因组静脉内膜增生厚度较其他组明显减少(P<0.01);转基因组细胞凋亡率较其他组明显增高(P<0.05)。结论纳米粒子可以作为转基因载体;沉默PKB基因表达能有效地抑制自体移植静脉内膜的增生,促进VSMC的凋亡。

氨基胍对大鼠胰腺移植保护作用的实验研究

目的探讨诱导型一氧化氮合酶抑制剂氨基胍对大鼠移植胰腺的保护作用。方法糖尿病大鼠模型30只随机分成3组:(1)空白对照组(n=6),仅开腹手术,不作移植;(2)移植对照组(n=6),仅作胰腺移植;(3)氨基胍处理组(n=18),移植胰腺恢复血运前经阴茎背静脉注入盐酸氨基胍(AG)溶液,剂量分别为60,80,100mg/kg。再灌注4h后检测血清一氧化氮(NO)水平,血糖以及淀粉酶活性,定量分析胰腺组织中的结构型一氧化氮合酶(cNOS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性,并对胰腺进行组织形态学和组织化学检查。结果与移植对照组比较,氨基胍处理组血NO水平及淀粉酶活性明显降低,胰腺病理损害较轻,其中以AG80mg/kg亚组效果更显著(P<0.01),且该亚组血糖及iNOS活性与表达也明显低于移植对照组(P<0.01)。结论诱导型一氧化氮合酶选择性抑制剂氨基胍在大鼠胰腺移植中起到保护作用。其作用机制可能与抑制NO的过量产生,减轻其作为自由基的细胞毒性有关。